厚朴酚两种提纯工艺的比较研究

袁 琳，孙东坡，程 寒，戴 康*

1中南民族大学药学院;2中南民族大学科研处武汉 430074

厚朴(Cortex Magnoliae officinalis)是我国传统、珍贵中药材，据《中国药典》2010年版一部收载，其来源为木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)或凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干燥干皮、根皮和枝皮。目前，在全国制药行业中利用厚朴配方的中成药多达200余种。厚朴的活性成分包括木脂素类(厚朴酚、和厚朴酚、三羟基厚朴酚、去三羟基厚朴酚、四氢厚朴酚、异厚朴酚)，挥发油(桉叶醇、聚伞花素、石竹烯、反丁香烯、芹子烯、杜仲烯、十六酸)，生物碱(木兰箭毒碱、氧化黄心树宁碱)和少量皂苷，鞣质等［1，2］。其中厚朴酚与和厚朴酚是厚朴的两种主要活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗溃疡和明显的中枢性肌肉松弛作用等多种生物学活性［2，3］，在临床上具有重要的作用及应用。厚朴的提取方法较多，但原有的提取方法［4-7］多用到碱进行分离和纯化，而含酚羟基的化合物在碱性条件下易氧化，导致提取产率下降以及增加提取困难。本研究比较了碱提酸沉法与乙醇浸提石油醚萃取法对厚朴酚进行分离纯化，后者尽可能的减少厚朴酚在碱性环境下的暴露以提高提取效率，且工艺流程简单，耗时短，所用试剂常规并可回收重复使用，整个提取过程不需要昂贵仪器。为工业大量生产提供一定的依据，也为开发厚朴有效成分新药提供原材料。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UItimata3000高效液相色谱(戴安中国有限公司);旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂);ZF-6型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司);AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(上海东玺制冷仪器设备有限公司);DZ-IBC真空干燥箱(天津市金泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

厚朴(购于广西省玉林市第三中药材市场，经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定为木兰科植物厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮);GF254薄层硅胶板10×20 cm(青岛海浪硅胶干燥剂厂);厚朴酚对照品(湖北省药检所)。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、环己烷、二氯甲烷(以上试剂均为分析纯);重蒸水。

2 方法与结果

2.1 厚朴酚的提取

2.1.1 碱提酸沉法

称取100 g厚朴，粉碎后加入600 mL 4%氨水，加热回流提取3次，每次4 h，并且每隔1 h从冷凝管顶端向烧瓶中加入氨水11 mL以保证溶液碱度在pH 11左右，提取液成棕黑色，合并三次的提取液，冷却后减压抽滤，滤液用盐酸调至pH 3，置4℃冰箱中静置，析出絮状沉淀，过滤，滤饼连带滤纸置于50℃烘箱中烘干，得7.05 g粗提物。将其剪碎，以环己烷280 mL加热回流3 h，过滤，取滤液在40℃旋转蒸发仪上浓缩，得到淡黄色晶体0.092 g。

将所得粗晶进行薄层色谱检测，以氯仿-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(27∶1)、石油醚-乙酸乙酯(7∶3)三种体系展开后在254 nm下监视及以1%硫酸香草醛显色后薄层板上都有两个斑点。因此法所获厚朴酚量过少且不纯，故未进行下一步的检测。

2.1.2 乙醇浸提石油醚萃取法

称取400 g厚朴，粉碎后以四倍体积乙醇浸泡24 h，室温下重复浸泡三次，将浸泡液过滤合并，于50℃在旋转蒸发仪上减压浓缩成小体积。然后用石油醚多次萃取，至石油醚层呈微黄色或接近无色，合并石油醚层液体并在40℃减压浓缩，静止冷却至室温，析出大量的方形晶体，表面吸附有少量的褐色油状物，析晶母液为黄绿色透明液。析晶移出在滤纸上吸除部分油状物，母液继续浓缩，静置，析出晶体，合并两次结晶。用二氯甲烷-石油醚(4∶1)进行多次重结晶得1.540 g晶体A。

重结晶:将晶体A置于100 mL烧杯中，先取12 mL二氯甲烷将晶体完全溶解，再加入3 mL石油醚，溶液稍出现混浊，静置，使溶剂自然挥发，待溶剂快挥发完毕时，即有多量晶体析出，移出上清夜，下层晶体继续用二氯甲烷溶解来多次重结晶，至晶体呈纯白色粉末。薄层色谱检测以氯仿-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(27∶1)、石油醚-乙酸乙酯(7∶3)三种体系展开后在254 nm下监视及以1%硫酸香草醛显色后薄层板上都仅有一个斑点为止，得化合物A晶体1.058 g。

2.2 定性检测

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取厚朴酚标准品9 mg，用甲醇溶解，配成0.9 mg/mL的对照品储备溶液。精密量取2 mL储备溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.18 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称定取待测晶体10 mg，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10 mL，摇匀，再精密量取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 TLC检测

将待检溶液和对照品液点在薄层板上，用氯仿-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(27∶1)、石油醚-乙酸乙酯(7∶3)展开后在254 nm波长下检测，及以1%硫酸香草醛显色后，薄层板上都仅有一个斑点，且与对照品在同一高度。

2.3 结构鉴定

化合物 A无色结晶;mp.100～102°C;UV(EtOH)λmax220，293 nm;1H NMR(DMSO，400 MHz)δ:9.013(2H，s，2-OH)，6.944(4H，d，H-4，H-6，H-4'，H-6')，6.809(2H，d，H-3，H-3')，5.936(2H，m，H-8，H-8')，5.043(4H，dd，H-9，H-9')，3.277(4H，d，H-7，H-7')。以上数据与文献［8］对照，确定化合物A为厚朴酚(magnolol)，其结构为:

图1 化合物A(厚朴酚)的化学结构Fig.1 Chemical structures of compound A(magnolol)

2.4 HPLC检测

2.4.1 色谱条件

色谱柱为Waters C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为甲醇∶水(78∶22);流动相流速为1.0 mL/min;检测波长254 nm;进样量20 μL;柱温30℃。

2.4.2 对照品溶液的制备

参照2.2.1。

2.4.3 供试品溶液的制备

参照2.2.2。

图2 厚朴酚标准品(A)与实验中纯化出的化合物A(B)的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of magnolol standard(A)and purified compound A(B)

从厚朴中提取、分离和精制出的厚朴酚经HPLC检测，其保留时间与标准品保留时间一致，初步判断为厚朴酚，其纯度达99%以上。

3 讨论

目前厚朴酚与和厚朴酚的研究已经比较充分，提取分离方法比较多，如碱提酸沉法、超声法、柱分离法、高速逆流色谱法、超临界流体萃取法等。本研究采用了乙醇浸提石油醚萃取法与常用的碱提酸沉法进行比较，结果表明乙醇浸提石油醚萃取法分离厚朴酚，具有简单易行、安全、耗时短、试剂毒性小且耗量少(可以回收重复利用)、不需要大型昂贵精密仪器设备等优点，后续处理实验容易，且所获产物纯度高(可达99%)，利于生产多量高纯度的厚朴酚。

在厚朴的提取过程中，最易干扰其纯度的是它的同分异构体和厚朴酚。在本提取工艺中，两步内就能够提取出厚朴酚，而没有受到和厚朴酚的干扰，分析原因可能是因为厚朴酚的极性较和厚朴酚小而其含量较和厚朴酚大，使其更易溶于非极性溶剂石油醚且含量较多，在此极性段内的杂质较少，厚朴酚的纯度较高，溶液饱和而析出厚朴酚晶体。此外，本工艺过程操作简便，步骤缩短减少了厚朴酚在空气中的暴露时间避免酚羟基的氧化，有利于厚朴酚活性的保持及减少其它成分的干扰。总之，乙醇浸提石油醚萃取法提取工艺设计简单可行，可望适用于工业大生产。

1 Cui CX(崔乘幸)，Xu GR(许光日)，Tang B(汤波).The separation and structure determination of components from EtOAc extract of magnolia officinalis.J Henan Inst Sci Tech，Nat Sci(河南科技学院学报，自科版)，2008，36:40-42.

2 Lee YJ，Lee YM，Lee CK，et al.Therapeutic applications of compounds in the Magnolia family.Pharm Ther，2011，130:157-176.

3 Zhang JH(张建和)，Fu WY(符伟玉)，Mo LE(莫丽儿).The overview of Cortex Magnoliae officinalis and it's extraction process.Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2004，15:313-314.

4 Lu JQ(卢金清)，Li SQ(李水清)，Wang M(王敏).The new extraction process of magnolol and honokiol from Cortex Magnoliae officinalis.Chin Tradit Pat Med(中成药)，1989，11(8):2-3.

5 Yu FW(于凤文)，Ji JB(计建炳)，Xu ZC(徐之超).Leaching of magnolol in Magnolia officinalis Rehd et Wils by power ultrasound.Chem Ind Eng Prog(化工进展)，2001，12:58-59.

6 Sun AL(孙爱玲)，Feng L(冯蕾)，Liu RM(柳仁民).Preparative isolation and purification of honokiol and magnolol from Magnolia Officinalis Rehd.Et Wils by high-speed countercurrent chromatography.Chin J Anal Chem(分析化学)，2005，7:1016-1018.

7 Guo XF(郭信芳)，Chen CB(陈昌彪)，Li HT(李弘弢)，et al.Isolation of magnolol and honokiol from Magnolia Officinalis Rehd.Et Wils by polyamide.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，1995，26:214-214.

8 Deng SM(邓世明)，Cheng YX(程永现)，Zhou J(周俊)，et al.Magnoquinone and neolignans from Magnolia rostrata.Acta Botanica Yunnanica(云南植物研究)，2001，23:121-125.