响应曲面法优化虫草素和虫草多糖的综合提取工艺

邓 黎，王晓虹，韩 涛，皮 立，韩 发

中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810008

现代科学论证冬虫夏草和蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。其中尤以虫草素、虫草多糖、虫草酸等多种生物活性物质的药用价值最为显著［1-4］。因此，冬虫夏草和蛹虫草受到了广泛关注，已有大量药品、保健食品上市，但这些产品多数停留在粗加工水平，缺乏市场竞争力，因此，要保证虫草产业能够持续稳定的发展，就必须要提高其加工产品的科技含量。因此，研究冬虫夏草和蛹虫草中主要生物活性物质的综合提取工艺和提高其提取率具有重要的经济价值和广阔的市场应用潜力［5，6］。

近年来，已有研究人员对虫草素和虫草多糖的综合提取进行了工艺改进和优化，但是所得到的优化工艺均是在单因素或正交试验条件下获得的［7，8］。响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化工艺条件的有效方法，可检查一个或多个响应变量与一系列试验变量之间的关系，确定试验因素及其交互作用在工艺过程中对指标响应值的影响，并精确地表述因素和响应值之间的关系［9］。因此，本研究中将响应面分析的方法应用于虫草中虫草素和虫草多糖的综合提取工艺研究中，建立得率与考察因素之间关系的数学模型，为工业化生产提供技术参数和理论依据。

在比较水热回流法和超声波水提法对综合提取虫草素和虫草多糖的影响基础上，采用超声波提取法进行初提，经醇沉、Sevage法除蛋白、乙醇分级沉淀后获得虫草多糖［3］，醇沉后获得的上清液用大孔树脂和反相硅胶分离纯化，制备型液相色谱分离制备获得虫草素［10］。最终利用响应曲面法考察超声提取时间、温度和液固比对虫草素和虫草多糖综合提取率的影响，得到最优提取工艺并予以验证。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱Agilent Eslipse-XDB C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，美国安捷伦公司;N-1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);KQ 5200 DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);METTLER TOLEDO PL 203和 XS 204电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);P70D17TL-D 5微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司);制备型高效液相色谱仪(LC-8A，日本);DHG-9070 A型电热恒温故风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

野生冬虫夏草购于青海玉树，人工培养蛹虫草CSM-8菌株由西宁世峰生物科技有限公司提供，样品经微波干燥后粉碎过60目筛备用;虫草素标准品、D-葡萄糖标准品由国家标准物质研究中心提供;甲醇为色谱纯，其余化学试剂均为分析纯;实验用水均为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 虫草素、虫草多糖提取率计算公式及含量测定方法

虫草素提取率计算公式:

式中C1为依据标准曲线计算出的被测液中虫草素浓度(mg/mL);C2为样品溶液中虫草素浓度(mg/mL)。

虫草多糖提取率计算公式:

式中C1为依据标准曲线计算出的被测液中虫草多糖浓度(mg/mL);C2为样品溶液中虫草多糖浓度(mg/mL)。

采用高效液相色谱法(HPLC)测定虫草素含量，色谱柱为Agilent Eslipse-XDB C18柱;流动相为甲醇-水(12∶88);流速0.8 mL/min;紫外检测波长260 nm;进样量 10 μL;室温。

苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量，样品溶液多糖含量的测定在标准曲线项下操作，测定OD值并得出样品中虫草多糖含量。

1.2.2 虫草素和虫草多糖综合提取分离工艺研究

1.2.2.1 提取方法比较实验

比较水热回流法和超声波水提法对综合提取虫草素和虫草多糖的影响。

水热回流提取法:精确称取0.10 g冬虫夏草和1.00 g预处理后的CSM-8子实体粉末，按液固比30 mL/g加入蒸馏水热回流提取6h，HPLC测定虫草素含量，苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量并计算提取率，实验重复3次。

超声波水提取法:精确称取1.00 g预处理后的CSM-8和0.10 g冬虫夏草子实体粉末，按液固比30 mL/g加入蒸馏水超声波提取30 min，温度55℃，HPLC测定虫草素含量，苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量并计算提取率，实验重复3次。

1.2.2.2 超声波提取单因素实验

分别考察超声温度(5、30、55、80、90 ℃)、超声提取时间(20、40、60、80、100 min)及液固比(10、20、30、40、50 mL/g)、超声提取次数(1 次、2 次、3 次、4次、5次)对人工蛹虫草CSM-8菌株子实体干粉中虫草素和虫草多糖含量的影响。

1.2.2.3 响应曲面法实验设计

在单因素实验的基础上选择对响应值(虫草素和虫草多糖提取率)有显著影响的因素，利用Design Expert软件对实验数据进行回归分析。每一变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码，模型选用二次方程:

其中Y为响应值(虫草素和虫草多糖提取率)，β0、β1、β2、β3、β12、β13、β23、β11、β22、β33为方程系数，x1、x2、x3为自变量编码值。

通过Box-Behnken设计和响应面分析来进一步考察超声提取时间、提取温度和液固比之间的相互影响，并确定超声波法综合提取子实体中虫草素和虫草多糖的最佳工艺参数。

称取1.00 g CSM-8菌株子实体粉末和0.10 g冬虫夏草子实体粉末，分别按最佳提取工艺参数进行验证实验，HPLC测定虫草素含量，苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量，并计算提取率，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 虫草素和虫草多糖综合提取分离工艺研究

2.1.1 提取方法比较实验结果与分析

比较水热回流法和超声波水提法综合提取虫草素和虫草多糖的提取效果，结果表明(表1):超声波水提法优于水热回流法，这是因为超声波使菌丝细胞破碎，有利于细胞内物质的溶出，使提取效果更好。故选择超声波水提法为综合提取虫草素和虫草多糖的方法。

表1 提取方法与虫草素、多糖提取率的关系(n=3)Table 1 Comparison of extraction results using water reflux method and Ultrasonication method(n=3)

2.1.2 超声波提取单因素实验结果与分析

2.1.2.1 超声温度对虫草多糖和虫草素含量的影响

在超声时间60 min、液固比7.5 mL/g、超声提取次数2次的条件下考察微波功率对人工蛹虫草子实体中虫草多糖、虫草素含量的影响，结果见表2。确定较优草上提取温度范围为30～80℃。

表2 超声温度对人工蛹虫草CSM-8菌株子实体干粉中虫草多糖、虫草素含量的影响Table 2 Effect of extraction temperature on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

2.1.2.2 超声时间对虫草素和虫草酸含量的影响

在超声温度为55℃、液固比7.5 mL/g、提取次数2次条件下考察超声时间对人工蛹虫草子实体中虫草素、虫草多糖含量的影响，结果见表3。确定较佳超声时间范围为40～80 min。

表3 超声时间对人工蛹虫草CSM-8菌株子实体干粉中虫草多糖、虫草素含量的影响Table 3 Effect of ultrasonic time on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

2.1.2.3 液固比对虫草素和虫草多糖含量的影响在超声温度55℃、超声时间60 min、超声提取次数2次条件下考察液固比对人工蛹虫草子实体中虫草多糖、虫草素含量的影响，结果见表4。确定较优液固比范围为20～40 mL/g。

表4 液固比对人工蛹虫草CSM-8菌株子实体干粉中虫草多糖、虫草素含量的影响Table 4 Effect of Water/material ratio on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

表5 提取次数对人工蛹虫草CSM-8菌株子实体干粉中虫草多糖、虫草素含量的影响Table 5 Effect of times of extraction on the content of polysaccharides，cordycepin in powdered fruit body of CSM-8

2.1.2.4 超声提取次数对虫草素和虫草酸含量的影响

在超声温度55℃、超声时间60 min、液固比30 mL/g条件下考察超声次数对人工蛹虫草子实体中虫草多糖、虫草素含量的影响，结果见表5。确定较优提取次数为2次。

2.1.3 响应曲面实验结果与分析

2.1.3.1 响应曲面法分析因素的选取及分析方案

在单因素实验的基础上固定提取次数为2次，采用Box-Behnken设计方案，分别以提取温度、提取时间和液固比对应3个独立变量X1、X2、X3，并以-1、0、1分别代表变量的水平。

对自变量进行编码(表6)。式中xi为变量的编码值，Xi为变量的真实值，X0为实验中心点变量的真实值，ΔX为单变量增量，虫草素和虫草多糖提取率Y为响应值，实验方案及结果见表6和7。

表6 实验因素水平及编码Table 6 Levels and codes of variable chose for Box-Behnken design

2.1.3.2 结果分析

Box-Behnken设计方案及虫草素和虫草多糖提取率的测定结果见表7。利用Design Expert软件对表7数据进行二次多元回归拟合，得到回归方程为:

表7 Box-Behnken设计方案及虫草素和虫草多糖提取率的测定值Table 7 Box-Behnken design and the responses of the total polysaccharide and cordycepin yield

对回归方程进行显著性检验及方差分析，结果见表8。由表8得出:两个模型的P均＜0.0001，表明两个模型都极显著且失拟项不显著(模型1，P=0.9388＞0.05;模型2，P=0.3796＞0.05)，相关系数R2=0.9955、R2=0.9888，说明两个模型拟合程度都很好。模型的调整确定系数 AdjR2=0.9897、AdjR2= 0.9745，说明模型 1能解释98.97%的响应值的变化，模型2能解释97.45%的响应值的变化，可以用模型1、2对超声波水提法综合提取虫草素和虫草多糖提取率进行分析及预测。

表8 回归模型的方差分析Table 8 ANOVA analysis for response surface quadratic model

模型1回归方程的系数显著性检验如下:一次项A(P＜0.0001)、C(P＜0.0001)，二次项 A2(P＜0.0001)、B2(P＜0.0001)均达到极显著水平，一次项B(P=0.0036＜0.01)达到显著水平，表明提取温度、超声提取时间、液固比对虫草素提取率有显著影响;二次项AB(P=0.0014＜0.0001)、BC(P=0.0050＜0.001)，表明提取温度与超声提取时间、提取时间与液固比间的交互作用对虫草素提取率的影响极显著。

模型2回归方程的系数显著性检验如下:一次项A(P＜0.0001)、B(P=0.0003＜0.001)，二次项 A2(P ＜0.0001)、B2(P ＜0.0001)、C2(P ＜0.0001)均达到极显著水平;一次项C(P=0.0020＜0.01)达到显著水平，表明提取温度、超声提取时间、液固比对虫草多糖提取率有显著影响;二次项AB(P=0.0003＜0.001)、AC(P=0.0383＜0.05)、BC(P=0.0348 ＜0.05)，表明提取温度与超声提取时间、提取温度与液固比以及提取时间与液固比的交互作用对虫草多糖提取率的影响显著。

利用Design Expert 7.0.0软件对表4数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程Y1的响应面及其等高线见图1、2和3。

从图1可知，虫草素提取率随提取时间的延长先升高后下降，呈抛物线趋势，当提取时间达到60 min左右时，提取率达到最大值，其原因可能是随着时间的增大，可溶性成分溶出的越多，使提取液粘度增大，在后期操作中有所损耗;提取时间和提取温度的交互作用对虫草酸素提取的影响显著，表现为曲面较陡，响应值随提取温度的变化率大于随提取时间的变化率，说明提取温度对提取率的影响大于超声提取时间;虫草素提取率随提取温度的升高而升高，当温度达到67.5℃后，提取率随温度的升高变化不大。图2可知，提取温度和液固比的交互作用对虫草素提取率的影响不显著，表现为曲面平滑。从图3可知，提取时间和液固比对提取率的影响均成抛物线形，即随提取时间和液固比的增大，提取率呈先升高后降低的趋势;提取时间和液固比的交互作用对虫草素提取的影响显著，表现为曲面较陡平滑;响应值随液固比的变化率大于提取时间，说明液固比对提取率的影响大于提取时间。

图1 提取温度和提取时间影响虫草素提取率的等值线与响应面Fig.1 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X2:extraction time)on the response Y1

图2 提取温度和液固比影响虫草素提取率的等值线与响应面Fig.2 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X3:liquid-solid ratio)on the response Y1

图3 提取时间和液固比影响虫草素提取率的等值线与响应面Fig.3 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X2:extraction time;X3:liquid-solid ratio)on the response Y1

图4 超声提取时间和提取温度影响虫草多糖提取率的等值线与响应面Fig.4 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X2:extraction time)on the response Y2

图5 提取温度和液固比影响虫草多糖提取率的等值线与响应面Fig.5 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X1:extraction temperature;X3:liquid-solid ratio)on the response Y2

图6 提取时间和液固比影响虫草多糖提取率的等值线与响应面Fig.6 Response surface plots(3-D)and contour plots(2-D)showing the effects of variables(X2:extraction time;X3:liquid-solid ratio)on the response Y2

利用Design Expert 7.0.0软件对表4数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程Y2的响应面及其等高线见图4、5和6。从图4可知，提取时间和提取温度的交互作用对虫草多糖提取的影响较显著，表现为曲面较陡，响应值随提取温度的变化率大于随提取时间的变化率，说明提取温度对提取率的影响大于超声提取时间;虫草多糖提取率随提取时间的延长先升高后降低，成抛物线趋势;虫草多糖提取率随提取温度的升高而升高，随后趋于平缓。从图5可知，提取温度和液固比的交互作用对虫草素提取的影响显著，响应值随提取温度的变化率大于随液固比的变化率，说明提取温度对提取率的影响大于液固比。从图6可知，提取时间和液固比对虫草多糖提取率的影响均成抛物线形，即随提取时间和液固比的同时增大，提取率呈先升高后降低的趋势;提取时间和液固比的交互作用对虫草多糖提取的影响显著，表现为曲面较陡;响应值随液固比的变化率大于随提取时间的变化率，说明液固比对虫草多糖提取率的影响大于超声提取时间。

利用Design Expert 7.0.0软件对回归模型进行进一步的典型性分析，得到最优提取工艺条件为:提取温度72℃，液固比30 mL/g，提取时间77 min，提取2次，虫草素提取率的理论值可达53.27%，虫草多糖提取率的理论值可达41.92%。

2.2 最佳工艺验证实验

最优工艺条件的验证实验结果如表9所示，3次重复实验的虫草素提取率的平均值为50.90%，RSD=1.09%，虫草多糖提取率的平均值为37.28%，RSD=1.42%，表明二次多项式建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件重现性好。

表9 验证实验结果(n=3)Table 9 Verification of optimal extraction conditions for the total polysaccharide yield(n=3)

2.3 超声综合提取冬虫夏草子实体中虫草素和虫草多糖

表10 超声提取冬虫夏草子实体中虫草素和虫草多糖实验结果(n=3)Table 10 Extraction yields of cordycepin and polysaccharide of C.sinensis using the optimized ultrasonic extraction conditions(n=3)

按照响应曲面法确定的最佳提取工艺参数，称取0.10 g冬虫夏草子实体粉末进行超声提取，实验结果见表10。设定提取温度73℃，液固比35 mL/g，提取时间65 min，提取2次，超声综合提取冬虫夏草子实体中虫草素的提取率平均值为50.20%，RSD=0.76%，虫草多糖的提取率平均值为36.92%，RSD=0.64%，表明所选工艺条件重现性好。

3 结论

综合提取虫草素和虫草多糖工艺条件和路线:采用超声波提取法进行初提，提取液浓缩、醇沉、离心，沉淀用Savage法除蛋白，乙醇分级沉淀获得虫草多糖，上清液用大孔树脂和反相硅胶分离纯化，制备型液相色谱分离制备获得虫草素。经响应曲面法确定的最优提取工艺条件为:提取温度72℃，液固比30 mL/g，提取时间77 min提取2次。以冬虫夏草和CSM-8菌株为原料，按照最佳提取工艺条件进行超声提取，测得虫草素提取率平均值分别为50.90%和50.20%，虫草多糖提取率平均值分别为37.28%和36.92%。

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