硫脲壳聚糖铜配合物与鲱鱼精DNA相互作用的研究

李小芳，冯小强*，杨 声

1天水师范学院生化学院，天水 741001;2定西师专，定西 743000

DNA是生命中重要的遗传物质，同时也是很多药物的靶点。药物与DNA相互作用的研究不仅有助于揭示药物的作用机理，同时对于新药的研发也具有重要的意义［1］。铜离子具有抗炎、杀菌、抗癌、抗凝血等药理作用。许多生物酶都依靠与铜元素的反应来激发活性，从而完成在生物体中对新陈代谢过程的催化作用。因此，铜配合物的合成及生物活性的研究成为一个焦点领域。硫脲壳聚糖铜(Thiourea-chitosan-Cu，简称 TUCS-Cu)，对 E．coli和 St．aureus具有显著的抑菌性能［2］。为了揭示其抑菌机理，探讨TUCS-Cu与DNA作用模式及其生物活性之间的关系，有助于人们对TUCS-Cu与DNA相互作用方式的理解，同时在分子和细胞水平上研究病因寻找具有抗肿瘤活性的药物有着重要的意义［3］，为研究TUCS-Cu在基因治疗领域的应用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

TUCS-Cu(制备方法见参考文献［2］)，用 1.0%(v/v)HAc溶解;鲱鱼精DNA美国Sigma公司产品，配制0.1 mg/mL贮备液备用。UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津);CHI660B电化学工作站(上海辰华)。

1.2 实验方法

1.2.1 循环伏安行为

实验在单室电解池中进行，三电极系统:工作电极为玻碳电极(GCE)，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝电极。

1.2.2 紫外吸收光谱

在1 cm×1 cm比色皿中加入0.1 mg/mL的DNA溶液 4 mL，用 TUCS-Cu滴定，摇匀，放置 5 min，以试剂空白为参比，扫描吸收光谱。滴定时每次加入体积为5 μL。

1.2.3 荧光光谱

比色皿中加入0.1 mg/mL的DNA溶液3 mL和NR溶液0.05 mL，用TUCS-Cu溶液进行滴定，以550 nm为激发波长，EX=EM=5 nm，测定荧光光谱。滴定时每次加入体积为5 μL。

1.2.4 粘度测定

DNA溶液粘度用乌氏粘度计测定，测定时固定DNA浓度为0.1 mg/mL，以不同的R(CTUCS-Cu/CDNA)加入配合物，温度恒定在25℃，作用30 min进行测量，得到(η/η0)1/3与配合物浓度关系。η为 DNA溶液在加入配合物时的粘度，η0为DNA溶液的粘度。

2 结果与讨论

2.1 TUCS-Cu与DNA作用的循环伏安行为

图1 扫速对TUCS-Cu电化学影响Fig.1 Effect of scan rate on the electrochemistry of TUCS-Cu

在0.1v/s的扫描速度下，TUCS-Cu在-0.2V附近有一还原峰，在0.258V和0.506V处有两个氧化峰，分别对应于Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)的氧化峰。从不同扫描速度下获得的循环伏安图可见(图1a)，氧化还原峰电流随着扫描速度的增大而增大(0.01～0.15v/s)，并与扫描速度的平方根呈现很好的线性关系y=1.05+8.56x(R=0.9979)(图1b)，表明中心铜离子在电极上的反应过程主要由扩散过程控制。

在4 mL 1.0 mg/mL的 TUCS-Cu溶液中，用DNA滴定，每次加入体积为10 μL，摇匀，放置 5 min，TUCS-Cu与DNA在稀溶液中相互作用的循环伏安曲线如图2所示。发现在配合物溶液中加入DNA后，循环伏安曲线发生了明显的变化，TUCS-Cu配合物的氧化峰电流明显降低且没有新的氧化还原峰出现，氧化还原峰电流急剧降低，且在0.506V的氧化峰电位发生正移，故峰电位差ΔE增大。Bard等提出，当金属配合物与DNA发生作用时，如果峰电位向负方向偏移，则金属配合物与DNA发生静电作用，如果峰电位向正方向偏移，则发生插入作用［4］，说明TUCS-Cu以嵌插作用与DNA分子作用形成了非电活性化合物［5］。由于该非电活性化合物在电极上没有电化学响应，而配合物与DNA相互作用导致溶液中游离配合物分子的浓度降低，使得单位时间内迁移到电极表面的配合物分子数量减少或扩散速度减小，从而导致峰电流减小。

图2 TUCS-Cu与DNA作用的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammetry figure of TUCS-Cu with DNA

2.2 TUCS-Cu与DNA相互作用的紫外吸收光谱

加入TUCS-Cu后，DNA体系的吸收光谱如图3所示。DNA在258 nm处有最大吸收峰，TUCS-Cu对DNA吸收光谱产生了明显的增色效应，且最大吸收波长红移至275 nm附近，说明TUCS-Cu与DNA发生了相互作用。根据Long理论，增色效应，最大吸收波长发生红移是该物质与DNA发生嵌插作用的标志［6］。明显的增色效应说明TUCS-Cu与碱基对之间的距离很近，即TUCS-Cu可能插入到DNA的碱基对中，从而引起DNA碱基对与嵌插的TUCSCu分子间产生较强的电子相互作用。

图3 TUCS-Cu对DNA紫外吸收光谱的影响Fig.3 Effect of TUCS-Cu on the UV absorption spectra of DNA

图4 TUCS-Cu对NR-DNA荧光光谱的影响Fig.4 Effect of TUCS-Cu on the fluorescence spectra of NR-DNA

2.3 TUCS-Cu与DNA相互作用的荧光光谱

中性红(NR)为一共轭平面稠环分子，能专一性地插入DNA双螺旋的碱基对之间，使荧光显著增强。TUCS-Cu存在下DNA-NR体系荧光强度的变化如图5所示。TUCS-Cu在此条件下无荧光，TUCS-Cu对DNA-NR体系荧光具有增强效应。荧光通常是发生于具有刚性平面结构的π-电子共轭的分子中，随着π-电子共轭度和分子平面度的增大，荧光效率也将增强。分子共平面性越大，π-电子共轭度越大;即任何有益于提高π-电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率。说明TUCS-Cu的荧光与NR类似，它能专一地嵌入DNA双螺旋的碱基对之间，使荧光显著增强，进一步说明了TUCS-Cu是以插入方式与DNA发生作用。

2.4 DNA溶液的粘度

图5 不同浓度TUCS-Cu对DNA粘度的影响Fig.5 Effects of increased amounts of TUCS-Cu on the viscosity of DNA

粘度一般被认为是确定配合物与DNA结合模式最有力的证据。当TUCS-Cu存在时，DNA的相对粘度降低，且随配合物浓度的增大呈现降低的趋势，如图5所示，表明TUCS-Cu与DNA发生了相互作用，这种插入方式使DNA得双螺旋发生扭结，导致其粘度降低［7］。

3 结论

采用循环伏安、紫外光谱和荧光光谱法研究了TUCS-Cu与鲱鱼精DNA的相互作用。结果表明，TUCS-Cu与DNA之间存在嵌插作用，而生成一种非电活性超分子复合物。

1 Smits KM，Schouten JS，Smits LJ，et al.A review on the design and reporting of studies on drug-gene interaction.J Clin Epidemiol，2005，58:651-654.

2 Li XF(李小芳)，Feng XQ(冯小强)，Yang S(杨声)，et al.preparation，Characterization and antibacterial activity of Thiourea-chitosan-copper(II)complex.Food Sci(食品科学)，2011，32(7):57-60.

3 Yu LL(于岚岚)，Yang R(杨冉)，Bai XX(白希希)，et al.Spectroscopic study of the interaction between camptothecin and DNA.Chin J Lumin(发光学报)，2011，32:1197-1203.

4 Zhang F(张芳)，Zhang QQ(张前前)，Zhu CJ(祝成坚)，et al.Synthesis and DNA binding spectroscopy studies of Cu(II)-Thr-Phen.Spectro Spectral Anal(光谱学与光谱分析)，2005，25:1439-1442.

5 Pasternack PF，Gibbs FJ，Villatrnaca J.Interactions of porphyrins with nucleic acids.J Biochem，1983，22:2406-2414.

6 Long EC ，Barton JK.On demonstrating DNA inter-calation．Acc Chem Res，1990，23:273-281.

7 Liu J，Lu TB，Li H，et al.DNA-bing and cleavage studies of a dinuclear copper(II)complex with a 26-membered exazamacrocycle.Transit Met Chem，2002，27:686-690.