跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义*

朱伶群， 曹 骥， 卢晓旭， 李 瑗， 欧 超， 苏建家， 杨 春△

( 1广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部， 2广西医科大学研究生学院，广西 南宁 530021)

跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义*

朱伶群1,2， 曹 骥1， 卢晓旭1,2， 李 瑗1， 欧 超1， 苏建家1， 杨 春1△

(1广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部，2广西医科大学研究生学院，广西 南宁 530021)

目的研究Smad3在人、大鼠、树鼩等不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义，进一步验证跨种属筛选肝癌关键蛋白研究策略的可行性。方法采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Smad3 mRNA和蛋白表达水平。结果Smad3 mRNA在人、大鼠和树鼩的肝癌中表达水平均低于其相应的癌旁组织(均P<0.05)；在大鼠肝癌组织中的表达低于正常肝组织(P<0.05)；在树鼩癌旁组织中的表达高于正常肝组织(P<0.05)；其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义(均P>0.05)。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌组织中的表达水平均低于其相应的癌旁组织及正常肝组织(均P<0.05)；在树鼩肝癌组织中的表达水平也低于相应的癌旁组织和正常肝组织，但差别无统计学意义(均P>0.05)；3个种属的癌旁组织与正常肝组织比较，差别无统计学意义(均P>0.05)。结论Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均下调，提示该蛋白表达水平的改变可能在肝癌发生发展中起重要作用，有可能成为防治肝癌的靶分子。

跨种属； Smad3蛋白； 肝肿瘤

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，以下简称肝癌)是全世界和我国最常见的恶性肿瘤之一，位于世界癌症死亡率的第3位，而全球55%以上的肝癌患者发生在我国[1]。目前已有大量基因被报道与肝癌的发生发展密切相关，却罕有一致认可者。基于在多个种属中共同表达的基因可能拥有更重要的保守功能这一认识，近年来国内外已将跨种属筛选肿瘤关键分子的策略应用于多种肿瘤的研究，结果表明，在人和动物的肿瘤发生发展过程中保守存在的共同改变基因，可能是诱发或促进肿瘤的关键分子[2]。我们前期通过基因组富集以及Meta分析的方法，从5套不同种属的肝癌基因表达芯片中筛选出转录水平发生改变的基因，Smad3即为其中之一[3]。Smad3是转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)通路中关键的调节信号分子之一，与肿瘤的发生发展及细胞增殖和凋亡的调控密切相关，可能对肝癌起着肿瘤抑制因子的作用[4-5]。目前国内外鲜有应用跨种属肿瘤基因筛选策略研究Smad3与肝癌关系的报道，Smad3基因是否为肝癌发生过程中的关键分子还有待进一步探讨。因此，本实验采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达, 以研究其在肝癌发生发展中的可能作用及意义。

材 料 和 方 法

1材料

1.1人肝及肝癌组织标本 收集广西医科大学附属肿瘤医院2009年1月～2011年12月手术切除并经病理证实的50例肝癌及对应癌旁组织(距离肿瘤边缘2 cm以外)和7例正常肝组织，正常肝组织来源于肝良性占位病变经手术切除者，组织于手术取下后先经液氮速冻再移至-80 ℃冰箱保存备用，肝癌病人术前均无放疗化疗史，患者年龄为24～70岁，中位年龄47.5岁。

1.2大鼠和树鼩肝及肝癌组织标本 大鼠肝癌及其相应癌旁组织(距离肿瘤边缘0.5 cm以外，肉眼观无特殊病变)15例,正常肝组织14例，树鼩肝癌及其相应癌旁组织(距离肿瘤边缘0.5 cm以外，肉眼观无特殊病变)10例,正常肝组织10例,均为本课题组前期项目[6-7]所保存。所有组织均为手术切除后先经液氮速冻然后转移到-80 ℃。

以上各组织类型标本均经病理组织学检查证实，见图1～3，各例人和动物的组织标本均作Smad3 mRNA表达水平的检测；其中人17例肝癌及其相应癌旁组织和5例正常肝组织、大鼠12例肝癌及其相应癌旁组织和3例正常肝组织、树鼩4例肝癌及其相应癌旁组织和3例正常肝组织作Smad3蛋白表达水平的检测。

Figure 1. The histopathological changes of HCC tissues (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (C) in human (HE staining,×400).

图1人肝癌、癌旁及正常肝组织的病理组织学改变

Figure 2. The histopathological changes of HCC tissuses (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (C) in rats (HE staining,×400).

图2大鼠肝癌、癌旁及正常肝组织的病理组织学改变

Figure 3. The histopathological changes of HCC tissuses (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (B) in tree shrews (HE staining,×400).

图3树鼩肝癌、癌旁及正常肝组织的病理组织学改变

1.3主要试剂与仪器 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen，逆转录试剂盒购自Fermentas，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。荧光定量试剂盒为TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司的SYBR® Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 试剂盒。Ⅰ 抗采用兔抗Smad3多克隆抗体购自Abcam，鼠抗GAPDH单克隆抗体购自北京中杉金桥公司，均适用于人和大鼠。Dylight680荧光标记的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗购自KPL。实时荧光定量PCR仪为ABI生产的ABI StepOneTM，红外荧光成像仪Odyssey为LI-COR产品。

2方法

2.1实时荧光定量PCR法检测组织中Smad3 mRNA表达 采用Trizol试剂提取组织总RNA；经微量核酸测定仪检测，A260/A280值在1.8～2.0之间为合格；以1.0%琼脂糖电泳和凝胶成像系统检测所提取的总RNA的完整性；取检验合格的RNA，按Fermentas公司逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成，产物于-20 ℃保存。应用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件在Smad3和GAPDH的高度保守序列区进行引物设计。Smad3上、下游引物序列分别为5’-TGCGAGAAGGCGGTCAAG-3’和5’-CCACAGGCGGCAGTAGAT-3’，产物长度为186 bp；内参照GAPDH上、下游引物序列分别为5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’和5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3’， 产物长度为200 bp。

根据试剂盒说明书，采用20 μL反应体系分别以Smad3和GAPDH引物进行扩增。反应体系含：SYBR® Premix Ex Taq (2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，灭菌去离子水6.8 μL，cDNA模板2 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个反应循环。同时，分别构建Smad3和GAPDH的标准曲线，并设置标准品的梯度稀释拷贝数。PCR扩增结束后，分析仪即显示标准曲线、扩增曲线和熔解曲线，根据各自标准曲线计算出待测样本中初始mRNA相对表达量。计算各组Smad3与对应内参照GAPDH初始相对mRNA表达量的比值，得到肝癌组、癌旁组和正常组数据作为Smad3 mRNA的相对表达量。将PCR扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，并将测序结果在NCBI的BLAST中进行比对。

2.2Western blotting检测组织中Smad3蛋白表达 分别取各例组织样本50～100 mg常规方法提取总蛋白，加入上样缓冲液煮沸变性，加样至SDS-PAGE胶上电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜；加 Ⅰ 抗(Smad3工作液浓度 1∶500，GAPDH工作液浓度1∶1 000)，过夜孵育，洗膜；加荧光 Ⅱ 抗(工作液浓度1∶7 500)，室温避光孵育1 h，洗膜；以Odyssey红外荧光成像仪扫描图像，读取灰度值。计算各组Smad3和内参照GAPDH的灰度值比值，得到肝癌组、癌旁组及正常组数据作为Smad3蛋白相对表达量。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析处理；各组计量资料数据用均数±标准差(mean±SD)表示；多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1总RNA质量及基因测序

所有样本总RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之间，琼脂糖凝胶电泳后成像显示28S、18S和5S条带清晰。测序所得序列经BLAST比对，显示各序列的同源性均在98%以上，即扩增产物序列与设计序列基本一致。

2实时荧光定量PCR反应

如图4所示，Smad3和 GAPDH的标准曲线直线相关系数分别为r=0.991和r=0.993，斜率(slope)分别为-3.856和-3.69。扩增曲线均呈S型，有明显的指数扩增期和平台期，曲线走行光滑，显示扩增结果理想,见图5。熔解曲线峰形窄而尖，峰单一无杂峰，见图6。

3Smad3mRNA在人、大鼠和树鼩肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达水平

实时荧光定量PCR结果显示，人肝癌组织Smad3 mRNA的表达量低于癌旁肝组织，差别有统计学意义(P<0.05)，肝癌组织Smad3 mRNA的表达量也低于正常肝组织，但差别无统计学意义(P>0.05)；癌旁肝组织与与正常肝组织比较，差别无统计学意义(P>0.05)。大鼠肝癌组织Smad3 mRNA的表达量低于癌旁肝组织和正常肝组织，差别有统计学意义(P<0.05)；癌旁肝组织与正常肝组织比较，癌旁肝组织Smad3 mRNA的表达量低于正常肝组织，差别无统计学意义(P>0.05)。树鼩肝癌组织及正常肝组织Smad3 mRNA的表达量均低于癌旁肝组织，差别有统计学意义(P<0.05)；肝癌组织与正常肝组织比较，差别无统计学意义(P>0.05),见图7。

4Smad3蛋白在人、大鼠和树鼩肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达水平

Western blotting结果显示，在人、大鼠和树鼩的肝癌组织中，Smad3蛋白的条带明显弱于癌旁及正常肝组织，而癌旁和正常肝组织比较则差异不明显，见图8～10。统计分析结果见图11，即人和大鼠肝癌组织Smad3蛋白的表达水平均显著低于癌旁肝组织和正常肝组织(P<0.05)；树鼩肝癌组织Smad3蛋白的表达低于癌旁和正常肝组织，但是差别无统计学意义(P>0.05)；人、大鼠和树鼩3个种属癌旁组织的Smad3蛋白表达水平与正常肝组织比较，差别无统计学意义(P>0.05)。

Figure 4. Real-time fluorescent quantitative PCR (RFQ-PCR) standard curves of Smad3 (A) and GAPDH (B).

图4Smad3和GAPDH实时荧光定量PCR标准曲线图

Figure 5. RFQ-PCR amplification plot of Smad3 (A) and GAPDH (B).

图5Smad3和GAPDH实时荧光定量-PCR扩增曲线图

Figure 6. RFQ-PCR melting curves of Smad3 (A) and GAPDH (B).

图6Smad3和GAPDH实时荧光定量PCR熔解曲线图

Figure 7. Expression of Smad3 mRNA in HCC tissues，peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew.Mean±SD.*P<0.05vsHCC tissues.

图7Smad3mRNA在人、大鼠和树鼩肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达

Figure 8. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in human HCC tissues (lane 1,3) peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6).GAPDH served as an internal control.

图8Westernblotting检测Smad3蛋白在人肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达

Figure 9. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in rat HCC tissues (lane 1, 3). peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6) GAPDH served as an internal control.

图9Westernblotting检测Smad3蛋白在大鼠肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达

Figure 10. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in tree shrew HCC tissues (lane 1,3).peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6).GAPDH served as an internal control.

图10Westernblotting检测Smad3蛋白在树鼩肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达

Figure 11. Expression of Smad3 protein in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew.Mean±SD.*P<0.05vsHCC tissues.

图11Smad3蛋白在人、大鼠和树鼩肝癌、癌旁和正常肝组织中的表达

讨 论

近年提出的跨种属肿瘤基因组学策略(cross-species oncogenomics approach)被认为是鉴定肿瘤基因的有力工具之一[8]。Colak等[9]通过基因芯片对人和大鼠早期肝癌进行分析，筛选出包括Smad3等在内的数个跨种属保守基因，认为其与早期肝癌的恶性转化密切相关，但未做进一步验证。我们也在前期研究中应用生物信息学等技术，跨种属地筛选出Smad3等一组肝癌差异表达基因。为进一步验证Smad3在多个种属的肝癌发生发展中表达水平的改变及研究其意义，本研究对人、大鼠、树鼩3个种属的肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织，应用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测Smad3 mRNA及蛋白的表达情况。结果显示，在转录水平上，3个种属肝癌组织的Smad3 mRNA表达水平均明显低于同一个体的癌旁肝组织；但将各种属的正常肝组织与肝癌、癌旁组织作比较，结果各不相同——我们推测此现象可能与种属特异性相关。在翻译水平上，3个种属肝癌Smad3蛋白表达水平均低于癌旁组织和正常肝组织，但树鼩各组蛋白水平相比较，差别无统计学意义，这可能与所用例数较少有关。此外，我们发现Smad3转录水平与翻译水平并非完全一致，其原因可能为：mRNA翻译为蛋白的过程中可能存在转录后调控等情况，导致两者表达水平不一致。蛋白作为基因功能的执行者，在生物功能中起着主要作用，且蛋白表达水平相对稳定，因此我们认为Smad3蛋白在3个种属的肝癌中相对于癌旁和正常肝组织均呈现低表达，提示Smad3基因在肝癌发生发展过程中可能发挥着关键分子的作用。

TGF-β通路作为人类疾病过程中最常发生改变的信号通路之一，与包括肝癌在内的多种肿瘤的发生发展密切相关[10]。Smads蛋白是目前所知最重要的细胞内TGF-β受体激酶底物, 可将TGF-β 信号直接由细胞外转导入细胞核。研究表明，TGF-β通路的生物学功能主要通过其下游的信号分子Smads进行调节[11]。Smad3作为Smads家族重要成员之一，在TGF-β介导的细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生发展和转移的过程中均起着至关重要的作用[4]。而在参与肿瘤发生发展的过程中，Smad3突变极为少见，主要表现为表达水平的改变[12]。目前已有大量研究证实Smad3在食管鳞状细胞癌、胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中均呈现低表达[13-14]，本实验结果也表明Smad3在人、大鼠和树鼩多种属的肝癌中呈低表达，提示Smad3表达水平降低或缺失可能与恶性肿瘤发生发展密切相关。目前，TGF-β通路的抑癌作用已被广泛认可，Smad3作为TGF-β信号通路的下游介质，它的丢失将可能导致TGF-β信号通路抑癌作用减弱或消失。近年研究发现，Smad3过表达可抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡[15]。因此，Smad3常被看作抑癌基因参与肿瘤调控。目前Smad3与肝癌关系的研究较少，其具体抑癌机制尚不明确。Yang等[15]通过转基因技术发现过表达Smad3能降低肝脏对化学诱癌的敏感性，同时可抑制Bcl-2的转录，从而诱导肝癌细胞凋亡；他们还发现Smad3高表达对正常肝组织功能无影响，但在肿瘤形成之初高表达的Smad3即开始发挥着肿瘤抑制因子的作用，认为Smad3在肝癌治疗方面拥有广阔的前景。此外，Kim等[16]通过免疫组化对肝癌病人Smad3水平进行了检测, 其生存率分析结果表明，Smad3在细胞质中表达阳性者，其无复发存活率和疾病相关存活率均较低，而其在细胞核中的表达与生存率无关，认为Smad3可作为判断肝癌术后复发及预后的一个重要标志物，对术后治疗有重要的指导意义。

总之，本研究验证了经跨种属策略筛选出的Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均呈现下调，这一结果一方面提示Smad3与肝癌的发生发展密切相关,可能为肝癌发生发展过程中的关键分子之一，另一方面还提示 Smad3可能发挥着抑癌基因的作用，但其具体机制仍有待进一步探讨。同时，本研究结果也证实了跨种属研究肿瘤相关基因的可行性。下一步，我们将通过体外及体内实验进一步观察Smad3对肝癌细胞生物学行为及肝癌发生发展过程的影响，其中包括：(1)通过肝癌细胞体外实验观察Smad3过表达对肝癌细胞增殖及凋亡等生物学行为的影响，并应用Western blotting及RT-PCR等技术进一步明确Smad3与主要周期、凋亡相关基因的关系；(2)通过裸鼠人肝癌移植瘤实验进一步观察Smad3过表达对移植瘤生长和转移的影响，从而深入探讨Smad3作为防治肝癌靶点的可能性。

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Cross-speciescomparisonofSmad3expressioninhepatocellularcarcinomatissues

ZHU Ling-qun1, 2, CAO Ji1, LU Xiao-xu1,2, LI Yuan1, OU Chao1, SU Jian-jia1, YANG Chun1

(1ResearchDepartmentofGuangxiCancerInstitute,2GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:cxl_yang@yahoo.com.cn)

AIM: To study the expression of Smad3 and its significance in hepatocellular carcinoma (HCC) in different species including human, rat and tree shrew, and to verify the feasibility of cross-species oncogenomic approach.METHODSReal-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blotting were applied to detect the expression of Smad3 at mRNA and protein levels in HCC tissues, corresponding HCC adjacent liver tissues and normal liver tissues collected from different species including human, rat and tree shrew.RESULTSThe mRNA expression of Smad3 in HCC tissues of human, rat and tree shrew was lower than those in the corresponding HCC tissues adjacent liver tissues. The mRNA level of Smad3 in HCC tissues of rat was lower than those in its normal liver tissues, while that in HCC adjacent tissues of tree shrew appeared higher than those in the normal liver tissues. No significant difference of Smad3 expression in other tissues was observed. The protein levels of Smad3 in HCC of human and rat were lower than those in the corresponding HCC adjacent liver tissues and the normal liver tissues. However, the protein expression of Smad3 was at a low level in HCC tissues of tree shrew and was lower than that in the HCC adjacent liver tissues and the normal liver tissues, although without statistical difference. The differences of Smad3 expression between HCC adjacent liver tissues and normal liver tissues in all the 3 species were not statistically significant.CONCLUSIONSmad3 is lowly expressed in HCC tissues of different species, suggesting that it might play a pivotal role in hepatocarcinogenesis and be applied as a key molecular target in HCC prevention and treatment.

Cross-species; Smad3 protein; Liver neoplasms

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.011

1000- 4718(2013)01- 0070- 06

2012- 08- 28

2012- 11- 21

国家自然科学基金资助项目(No.30960428)；广西自然科学基金资助项目(No.2012GXNSFAA053167)

△通讯作者 Tel:0771-5310593; E-mail: cxl_yang@yahoo.com.cn