PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡*

费洪荣， 赵 莹， 王桂玲， 曲晓兰， 王凤泽

(泰山医学院 1药学院， 2生物科学学院， 3医药生物技术研究所，山东 泰安 271016)

PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡*

费洪荣1， 赵 莹1， 王桂玲1， 曲晓兰1， 王凤泽2,3△

(泰山医学院1药学院，2生物科学学院，3医药生物技术研究所，山东 泰安 271016)

目的检测PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。方法MTT法检测细胞活力；流式细胞术分析细胞周期变化；Annexin V-FITC/PI双标法测定细胞凋亡；免疫印迹分析细胞内蛋白表达的变化。结果PF-04691502处理SGC-7901细胞后，降低细胞的活力并促进细胞阻滞于G1期，同时抑制cyclin D1的表达并上调p21的蛋白水平。PF-04691502可明显诱导SGC-7901细胞凋亡，其机制与其促进caspase家族成员的活化并切割聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP] 底物密切相关。结论PI3K/mTOR 双重抑制剂PF-04691502能够通过阻滞细胞周期来抑制SGC-7901细胞的增殖，同时能够激活细胞内caspase，使PARP发生剪切而诱导细胞凋亡。

PF-04691502； PI3K/mTOR； 细胞增殖； 细胞凋亡； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶类

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信号途径作为真核细胞内重要信号转导通路之一，与肿瘤的发生发展密切相关[1-2]。 PI3K是一个脂激酶家族，参与调控细胞的增殖、凋亡和分化等生命过程；mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其羧基末端与PI3K催化区高度同源，是PI3K信号通路的一个关键调节位点[3]。研究发现，多种实体瘤的发生与PI3K/Akt/mTOR信号通路的突变或过度活化密切相关，因此抑制该信号途径已成为临床上肿瘤治疗的有效手段，筛选PI3K/Akt/mTOR抑制剂并研究其抑癌活性则具有重要的理论意义与治疗价值[4-5]。本研究以人胃癌SGC-7901细胞为实验材料，检测PI3K和mTOR的双重靶向抑制剂PF-04691502对SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响，从而为胃癌临床用药提供理论指导与实验依据。

材 料 和 方 法

1细胞培养

人胃癌细胞株SGC-7901购自南京凯基生物有限公司，于37 ℃和5% CO2条件下用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。

2试剂

PF-04691502 购自 Selleck Chemicals；RPMI-1640 培养基和胎牛血清购自 Gibco；MTT购自Genview；propidium iodide (PI)购自Sigma-Aldrich；Annexin V-FITC 购自南京凯基生物有限公司；caspase-3抗体、caspase-8抗体、caspase-9抗体和多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抗体购自Cell Signaling Technology；β-actin抗体购自Sigma；cyclin D1抗体和p21抗体购自Santa Cruz；Ⅱ抗均购自北京中杉金桥生物公司。

3MTT检测细胞活力

SGC-7901细胞接种于96孔板中，用不同剂量的PF-04691502 处理后继续培养24 h，对照组加入DMSO；终止培养前4 h加20 μL(5 g/L)的MTT。吸去培养基后加入150 μL DMSO，室温振荡5～10 min；490 nm波长下测定各孔的吸光度，以同样的方法测6个平行孔的吸光度读数并计算平均值。

4流式细胞术检测细胞周期与凋亡

PF-04691502处理SGC-7901细胞24 h后，胰酶消化并制备单细胞悬液；用75%冷无水乙醇4 ℃固定过夜后加入50 mg/L RNase A，37 ℃ 孵育30 min，加50 mg/L PI闭光染色 15 min，接着上机检测并分析细胞的周期分布。细胞凋亡检测操作参照试剂盒说明书进行，根据Annexin V和PI的荧光强度计算凋亡百分率。实验重复3次。

5免疫印迹实验

RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞20 min，4 ℃ 13 000×g离心20 min后收集上清并定量分析。取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE分离蛋白，然后电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后加入Ⅰ抗；室温孵育3 h后加入Ⅱ抗孵育1 h后暗室曝光显影。

6统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD) 表示，均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1PF-04691502抑制SGC-7901细胞的增殖

SGC-7901细胞经不同剂量的PF-04691502处理24 h后，MTT法检测细胞活力，结果见图1，PF-04691502抑制了SGC-7901细胞的活力。

Figure 1. PF-04691502 reduced the viability of SGC-7901 cells. Cells were incubated with PF-04691502 at the indicated concentrations for 24 h and then processed for MTT assay. Mean±SD.n=6.

图1MTT法检测PF-04691502对SCC-7901细胞活力的抑制作用

2PF-04691502阻滞SGC-7901细胞于G1期

采用流式细胞术检测了PF-04691502对SGC-7901细胞周期的影响，发现PF-04691502作用于SGC-7901细胞后，细胞明显阻滞于G1期，而处于S期的细胞数目则明显减少，见图2。

Figure 2. PF-04691502 treatment resulted in cell cycle arrest at G1stage. SGC-7901 cells were exposed to different concentrations of PF-04691502 for 24 h. The cell cycle analysis was determined by PI staining and flow cytometry. Mean±SD.n=3.

图2PF-04691502作用SGC-7901细胞24h后，流式细胞术分析细胞周期的变化

免疫印迹结果表明，PF-04691502诱导细胞G1期阻滞与其抑制cyclin D1的蛋白水平，并上调p21的表达密切相关，见图3。

Figure 3. PF-04691502 down-regulated cyclin D1 expression and up-regulated p21 expression in SGC-7901 cells. Cells were cultured for 24 h in the presence of increasing doses of PF-04691502. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μ mol/L.

图3PF-04691502对SGC-7901细胞中cyclinD1及p21表达的影响

3PF-04691502对SGC-7901细胞凋亡的影响

SGC-7901细胞经PF-04691502处理后，细胞发生明显的凋亡，见图4。

免疫印迹结果显示，SGC-7901细胞经PF-04691502作用24 h后，caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP出现明显的活性切割，见图5。

讨 论

近年的研究发现，PI3K/Akt信号途径参与肿瘤细胞的增殖、存活、分化及血管生成等生命过程，设计筛选该信号通路的特异性抑制剂对癌症的临床治疗具有非常重要的实际意义[6-7]。本研究检测PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502对SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响，发现PF-04691502抑制了胃癌细胞的生存力，且抑制作用呈剂量依赖性(图1)。流式结果表明PF-04691502诱导SGC-7901细胞阻滞于G1期，其机制与PF-04691502抑制SGC-7901细胞中cyclin D1的蛋白水平，增加了p21的表达相关。

化合物的抗癌活性与肿瘤细胞的凋亡关系密切[8]。本研究检测了PF-04691502对SGC-7901细胞凋亡的影响，发现PF-04691502可诱导胃癌细胞发生明显的凋亡现象。细胞凋亡的执行可以通过内源性和外源性2条途径执行。在内源性的凋亡途径中，细胞色素C 与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)促使pro-caspase-9 与两者结合形成凋亡小体同时活化caspase-9；激活的caspase-9 又活化caspase-3，将PARP切割成小片段，使PARP的活性丧失[9-10]。在本研究中，胃癌细胞SGC-7901 经PF-04691502作用24 h后，促进procaspase-9 和procaspase-3剪接成有活性的caspase-9 和caspase-3。在外源性细胞凋亡信号通路中，细胞通过激活的死亡受体招募接头蛋白Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)，FADD进而募集并激活caspase-8从而启动细胞凋亡。本实验结果表明，caspase-8的切割产物随着PF-04691502浓度的增加而增多(图5) 。

Figure 4. PF-04691502 induced apoptosis of SGC-7901 cells. Cells were incubated with the indicated concentrations of PF-04691502 for 24 h, and the apoptosis was determined by Annexin V/PI staining analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

图4AnnexinV/PI检测PF-04691502对SGC-7901胃癌细胞凋亡的影响

Figure 5. PF-04691502 treatment activated the cleavage of caspase-3, caspase-8, caspase-9 and PARP in SGC-7901 cells．CF:cleaved fragment.

图5PF-04691502对caspases家族主要蛋白因子和PARP活性切割的影响

总之，PF-04691502能够抑制SGC-7901胃癌细胞的增殖，阻滞细胞于G1期；PF-04691502可通过激活caspases的活性切割而诱导SGC-7901细胞发生凋亡现象。本研究为PF-04691502用于胃癌的临床治疗提供了理论基础与实验依据。

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PI3K/mTORdualinhibitorPF-04691502inducesapoptosisofhumangastriccancerSGC-7901cells

FEI Hong-rong1, ZHAO Ying1, WANG Gui-ling1, QU Xiao-lan1, WANG Feng-ze2,3

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiologicalSciences,3InstituteofMedicinalBiotechnology,TaishanMedicalUniversity,Taian271016,China.E-mail:wfz221@sina.com.cn)

AIM: To determine the antitumor effect of PF-04691502, a dual inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and mammalian target of rapamycin (mTOR), on the viability and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901.METHODSCell viability was analyzed by MTT assay. Cell cycle was detected by flow cytometry, and Annexin V-FITC/PI dual staining was used to detect cell apoptosis. Protein expression of p21, cyclin D1, caspase-3, caspase-8, caspase-9 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) was determined by Western blotting.RESULTSMTT assay and cell cycle analysis results indicated that PF-04691502 inhibited the viability of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner, and arrested the cells in G1phase. PF-04691502 down-regulated the expression of cyclin D1 and up-regulated the expression of p21. In addition, SGC-7901 cells treated with PF-04691502 showed typical characteristics of apoptosis, accompanied by activation of caspases and cleavage of PARP.CONCLUSIONThe PI3K/mTOR dual inhibitor PF-04691502 induces the apoptosis and inhibited the growth of SGC-7901 cells, implicating its potential therapeutic value for the treatment of cancer.

PF-04691502; PI3K/mTOR; Cell proliferation; Apoptosis; Caspases

R966

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.008

1000- 4718(2013)11- 1962- 04

2013- 06- 04

2013- 07- 15

国家自然科学基金资助项目(No. 81272683)； 山东省自然科学基金资助项目(No. ZR2011HQ034)

△通讯作者 Tel: 0538-6236075； E-mail:wfz221@sina.com.cn