骨髓间充质干细胞、肿瘤坏死因子受体Ⅱ-抗体融合蛋白和美沙拉嗪对TNBS诱导的结肠炎大鼠疾病活动指数与组织损伤指数的影响*

吴新环， 黄花荣， 钟英强△， 叶小研， 王 琳

(中山大学孙逸仙纪念医院 1消化内科， 2儿科， 3病理科, 广东 广州 510120)

骨髓间充质干细胞、肿瘤坏死因子受体Ⅱ-抗体融合蛋白和美沙拉嗪对TNBS诱导的结肠炎大鼠疾病活动指数与组织损伤指数的影响*

吴新环1， 黄花荣2， 钟英强1△， 叶小研1， 王 琳3

(中山大学孙逸仙纪念医院1消化内科，2儿科，3病理科, 广东 广州 510120)

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)、肿瘤坏死因子受体Ⅱ-抗体融合蛋白(TNFRⅡ-IgG)和美沙拉嗪对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎大鼠疾病活动指数(DAI)与组织损伤指数(TDL)的影响。方法MSCs应用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养。TNBS/乙醇灌肠诱导SD大鼠结肠炎模型。81只SD大鼠随机分成正常对照组(n=15，A组)、结肠炎组(n=15，B组)、MSCs治疗1组(3×106MSCs,n=15，C组)、MSCs 治疗2组(5×106MSCs,n=15，D组)、TNFRⅡ-IgG治疗组(n=6，E组)和美沙拉嗪治疗组(n=15，F组)。采用DAI描述大鼠的表现，大体CMDI描述肠道的肉眼下表现，TDI评价肠道组织学改变。结果MSCs经过3次传代后可纯化。B组大鼠各时点DAI、CMDI和TDI评分均显著高于A组(P<0.05)；第6天除A组外各组大鼠评分之间无明显差异(P>0.05)；第9天 C组、D组和F组各评分均低于B组(P<0.05)，C组评分与D组无显著差异(P>0.05)；第14天 C、D、E和F组评分均低于B组(P<0.05)，其中F组评分最高(P<0.05)，E组次之(P<0.05)，D组评分最低(P<0.05)。结论MSCs、TNFRⅡ-IgG和美沙拉嗪灌肠液可显著改善TNBS诱导的结肠炎大鼠第14天的DAI、CMDI和TDI指标，其中效果最好的是MSCs，其次是TNFRⅡ-IgG，美沙拉嗪灌肠液效果较差。

骨髓间充质干细胞； 肿瘤坏死因子受体Ⅱ-抗体融合蛋白； 美沙拉嗪； 炎症性肠病； 大鼠

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的病因与发病机制迄今尚未完全阐明，主要涉及遗传、免疫、感染与环境因素。目前传统的药物以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)抗体对IBD的治疗作用主要是缓解症状和促进肠道病损黏膜的愈合，而无法彻底治愈IBD，且其不良反应也较多；TNF受体Ⅱ(TNF receptorⅡ，TNFRⅡ)-抗体融合蛋白(TNFRⅡ-IgG)治疗类风湿性关节炎的研究较多[1]，但应用其治疗IBD的研究很少。近年研究表明骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是IBD的一种新型有效的治疗方法[2]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TBNS) /乙醇灌肠造模法属于正常免疫系统下的半抗原诱导性模型制备方法，是目前应用最广泛的一种肠道炎症模型，该方法诱发的体内免疫反应以Th1型反应为主，类似于人类的克罗恩病(Crohn disease，CD)[3]。本实验观察并比较MSCs、TNFRⅡ-IgG和美沙拉嗪对TNBS诱导的结肠炎模型大鼠的疾病活动指数(disease activity index,DAI)与组织损伤指数(tissue damage index,TDI)的影响。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(200±10)g(6周龄)或(100±10)g(4周龄),均购自中山大学实验动物中心。饲养条件均为SPF级，昼夜节律为12 h/12 h，无特殊实验要求时正常供应饲料和饮水。购入后适应性饲养1周。

1.2主要试剂与药物 低糖DMEM培养基(Gibco)；0.25%含EDTA胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；大鼠单克隆抗体：anti-CD29(Biolegend)，anti-CD45(Biolegend)，anti-CD34(Santa Cruz)，anti-CD44(Santa Cruz)；50 g/L TNBS溶液(Sigma)；重组人TNFRⅡ-IgG(上海中信国健药业有限公司)；美沙拉嗪灌肠液(Falk)。

2方法

2.1SD大鼠骨髓MSCs的分离、培养与鉴定 原代培养采取全骨髓法。4周龄SD大鼠颈椎脱臼处死后75%乙醇中浸泡10 min，移入超净台，截取双下肢股骨与胫骨，剪开两侧骨端，用无血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔至发白为止，将获得的骨髓细胞悬液移入离心管，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，用含10%胎牛血清的低糖DMEM重悬，接种于25 cm2培养瓶中，放置于5%CO2、37 ℃培养箱内。以后每3 d换液1次，当长到80%～90%融合时，以1∶2传代培养[4]。取第4代细胞,制成1×109/L的单细胞悬液,每管加入100 μL相关抗体，室温避光孵育20 min，流式细胞术检测CD29、CD34、CD44和CD45的表达。第5代细胞作移植用。

2.2TNBS诱导的结肠炎模型建立 造模前禁食不禁水48 h, 禁食24 h后刺激大鼠以排出大肠远端的大便，共2次，之间相隔6 h以上，排空大便后腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉。手提大鼠尾部，使大鼠倒立，将一直径2.0 mm 长约12 cm 的硅胶管从肛门轻柔插入结肠距肛门缘8 cm 处，一次性注入含TNBS的50%乙醇溶液(TNBS按照80 mg/kg给药加上等体积的无水乙醇)，5 s灌完，灌完后维持倒立位置30 s～60 s，防止漏出药液[3]。

2.3实验分组与给药方法 体重为(200±10)g成年雌性大鼠随机分为6组(A、B、C、D、E与F组，后5组在第0天接受TNBS灌肠诱导结肠炎模型)。A组为正常对照组(n=15，不做任何干预处理)；B组为结肠炎造模组(n=15，第2天尾静脉注射1 mL DMEM);C组为MSCs治疗1组(n=15，第2天尾静脉注射1 mL含有3×106MSCs的细胞悬液)；D组为MSCs治疗2组(n=15，第2天尾静脉注射1 mL含有5×106MSC的细胞悬液)；E组为TNFRⅡ-IgG治疗组(n=6，从第7天开始在每天的同一时段皮下注射直至第13天)；F组为美沙拉嗪治疗组(n=15，从第2天开始给予美沙拉嗪灌肠液直至第13天)。美沙拉嗪灌肠液的剂量为100 mg·kg-1·d-1[5]。TNFRⅡ-IgG的剂量为5 mg·kg-1·d-1[6]。除E组外其他组分别在第6天、第9天、第14天处死5只大鼠，E组在第14天处死6只大鼠。

3观察指标与评分方法

3.1大鼠的一般情况 每天固定时段内观察大鼠精神状态、活动、毛发光泽、饮食情况等并记录体质量变化、大便性状和便血情况并进行评分。DAI评分标准见表1[7]。DAI=(体重下降分数+粪便性状分数+隐血分数)/3。大便性状正常是成形大便；稀便是糊便或者半成形大便但不黏附肛门；腹泻是水样便并且黏附肛门。

表1 疾病活动指数的评分标准

3.2结肠组织大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index, CMDI)评分 戊巴比妥钠致死剂量处死大鼠后，取末端大肠10 cm，纵行切开后用冰生理盐水冲洗干净后肉眼观察大肠黏膜损伤情况，并进行CMDI评分[6]。评分标准1：0分，没有损伤；1分，充血，无溃疡；2分，点状或线性溃疡，无明显的炎症；3分，有1个明显炎症表现的溃疡；4分，2个或更多的溃疡或者炎症部位；5分，2个或者更多的有炎症表现的溃疡，或者有一溃疡/炎症的范围超过了1 cm；6～10分，如果损伤范围超过了2 cm，范围每多1 cm评分就加1分。评分标准2：0分，没有粘连；1分，轻度粘连(跟其它组织容易剥离)；2分，重度粘连。总分=评分1+评分2。

3.3组织损伤指数评分 剪取部分病变组织立即放于4%的多聚甲醛液中固定，石蜡包埋后切片，HE染色后行TDI评分[8]，见表2。

表2 组织学损伤指数的评分标准

4统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件，数据以均数±标准差(mean±SD)描述，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1SD大鼠骨髓MSCs培养后形态与鉴定

原代培养3 d后换液，显微镜下可见MSCs呈梭形、三角形及多角形，可见散在的由MSCs形成的细胞集落，也可见少量圆形透亮的杂细胞。3～6 d细胞数量迅速增多，呈漩涡状生长，10 d后可长到90%融合。传代后细胞生长速度明显增快，细胞形态仍为梭形或多角形，有粗大突起，6～7 d可长满。杂细胞随传代减少，到第3代MSCs可达到明显纯化，见图1。流式细胞术结果显示：第4代MSCs表达CD29及CD44，不表达CD34及CD45。CD29和CD44的阳性率分别为(98.26±0.52)%和(98.98±0.49)%，提示细胞为MSCs，见图2。

Figure 1. Morphological feature of MSCs under phase-contrast microscope (×100). A: passage 0； B: passage 5.

图1相差显微镜下原代和第5代大鼠MSCs的形态

Figure 2. Expression of markers CD29 (A), CD34 (B), CD44 (C) and CD45 (D) in rat MSCs tested by flow cytometry.

图2流式细胞术检测大鼠第4代MSCs表面CD抗原的表达

2TNBS/乙醇诱导SD大鼠结肠炎模型

采用TNBS/乙醇灌肠后发现结肠炎模型大鼠DAI、CMDI和TDI评分显著高于正常对照组大鼠，结肠炎模型大鼠经TNBS诱导后第2天出现腹泻、脓血便和体质量下降，大鼠结肠组织表现为肠管增粗和肠壁增厚，并与腹腔内组织粘连，肠黏膜明显充血水肿、糜烂和溃疡形成。镜下可见炎症累及结肠肠壁全层，大量炎症细胞(中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性细胞)浸润，并可见肠黏膜腺体结构破坏，肠上皮不完整及脱落，糜烂以及溃疡形成。从第9天开始大鼠体重缓慢增加，腹泻与便血减轻，持续至第14天。

3各组大鼠的DAI评分

除正常组外，各组大鼠症状在前6 d无明显差异。B组第6天DAI评分明显高于A组(P<0.01)，稍高于C、D和F组，但差异无统计学意义(P>0.05)。第9天 C、D和F组的DAI评分明显低于B组(P<0.01)。第14天 C组、D组、E组和F组的DAI评分明显低于B组(P<0.01)，F组高于E组(P<0.05),C组和D组低于E组(P<0.01),C组高于D组(P<0.01),见表3。

表3各组大鼠DAI评分

Table 3. The score of disease activity index in every group (mean±SD)

Groupn6d9d14dA15000B153．00±0．23∗∗2．93±0．282．00±0．23C152．80±0．18∗∗1．67±0．24##0．67±0．47##D152．73±0．28∗∗1．60±0．27##0．13±0．30##E61．05±0．33##F152．85±0．32∗∗2．56±0．30##1．43±0．35##

**P<0.01vsgroup A；##P<0.01vsgroup B.

4各组大鼠CMDI评分

第6天 B、C、D和E组CMDI评分明显高于A组(P<0.01)，B、C、D和F组之间无明显差异(P>0.05)。第9天 B组CMDI评分明显高于A组(P<0.01)，C组和D组低于B和F组(P<0.01)，C组和D组之间无明显区别(P>0.05)，F组低于B组(P<0.01)，与第6天 相比无明显差别(P>0.05)。第14天 B组CMDI评分明显高于A组(P<0.01)，C、D、E和F组明显低于B组(P<0.01)，F组评分高于C、D和E组(P<0.05),C组和D组CMDI评分低于E组(P<0.05)，D组稍低于C组(P<0.05),见图3、表4。

5各组大鼠TDI评分

第6天 B、C和D组TDI评分明显高于A组，B、C、D和F组之间评分无明显差异(P>0.05)。第9天B和F组 TDI评分高于C组和D组(P<0.01)，B组高于F组(P<0.05)。第14天 B组TDI评分高于A、C、D、E和F组(P<0.01)，F组评分高于C、D和E组(P<0.01),E组评分高于C与D组(P<0.05),C组评分高于D组(P<0.05),见图4、表5。

Figure 3. Macroscopic changes of rat colons in different groups on day 14. A: normal control group, normal gut; B: colitis group, one ulcer of three centimeters; C: MSCs treatment 1 group, local hyperemia, no ulcer; D: MSCs treatment 2 group, no hyperemia, no ulcer; E: TNFR Ⅱ-IgG treatment group, local hyperemia, no ulcer; F: mesalazine treatment group, ulcer with significant inflammation.

图3第14天各组大鼠结肠的大体图片

表4各组大鼠CMDI评分比较

Table 4. The score of colon macroscopic damage index of rats in the 6 groups (mean±SD)

Groupn6d9d14dA15000B159．00±0．70∗∗9．20±0．83∗∗7．80±1．10∗∗C158．60±0．54∗∗4．20±0．83##2．40±0．89##D158．40±0．55∗∗3．60±0．14##1．20±0．44##E63．50±1．04##F158．70±0．89∗∗8．00±0．31##4．67±1．03##

**P<0.01vsgroup A；##P<0.01vsgroup B.

Figure 4. Histological changes of rats colons in 6 groups on day 14 (HE staining,×100). A: normal control group, normal mucosa; B: colitis group, transmural inflammation, entire crypt and epithelium lost; C: MSCs treatment 1 group, almost complete regeneration; D: MSCs treatment 2 group, complete regeneration; E: TNFRⅡ-IgG treatment group, epithelium regeneration with crypt depletion; F: mesalazine treatment group, surface epithelium intact.

图4第14天各组大鼠结肠组织病理学改变

表5各组大鼠TDI评分比较

Table 5. The score of tissue damage index of rats in the 6 groups(mean±SD)

Groupn6d9d14dA15000B1516．00±0．70∗∗15．20±0．4411．60±1．14C1515．80±0．83∗∗8．40±0．89##2．80±0．83##D1515．60±0．54∗∗8．20±0．44##1．60±0．55##E63．83±1．16##F1515．90±0．65∗∗14．60±0．83#7．50±0．54##

**P<0.01vsgroup A；#P<0.05，##P<0.01vsgroup B.

讨 论

MSCs与生物制剂对促进黏膜愈合已成为当今IBD研究的热点问题之一，而美沙拉嗪对轻度的黏膜炎症有一定的修复作用，在同一炎症程度的动物模型中，三者对炎症黏膜的修复作用如何，相关的研究很少。TNBS/乙醇诱导SD大鼠结肠炎程度可直接影响到实验干预的效果，在预实验中发现使用TNBS/乙醇100 mg/kg的剂量大鼠体重下降明显，脓血便严重，死亡率高，逐步减量至80 mg/kg，灌肠后发现结肠炎模型大鼠表现与Morris等[3]的研究大致相同，灌肠所用的TNBS剂量与Li等[5]的不一致，与杨晓彤等[9]的研究一致。在该模型下，本组资料发现美沙拉嗪组大鼠DAI、CMDI和TDI评分在第14天评分明显低于结肠炎组，但是大鼠体质量增长不明显，糊便多见；肠黏膜充血水肿，糜烂和溃疡仍可见；镜下仍可见少量到中量炎症细胞浸润，可见隐窝损伤。治疗效果不佳且起效时间慢，这与Feagan等[10]的报道有所区别。这可能与药的剂型、给药方式和动物的炎症程度有关。

TNFRⅡ-IgG主要应用治疗类风湿性关节炎，并在多个大规模随机对照试验[11-12]证实了依那西普(国外上市的TNFRⅡ-IgG制剂)的疗效。TNFRⅡ-IgG在IBD中应用的研究很少。本组资料显示TNFRⅡ-IgG治疗组可明显缓解大鼠消瘦、血便等症状，减轻结肠的损害，促进肠上皮细胞再生，提示TNFRⅡ-IgG能明显减轻TNBS诱导的结肠炎症。TNFRⅡ-IgG在用药后3 d已经起效，且在用药7 d后发挥明显的治疗作用，与美沙拉嗪组相比显示出明显的优势。TNFRⅡ-IgG的治疗机制可能通过抑制炎症诱导的肠上皮细胞凋亡从而减轻TNBS诱导的结肠损害[13]。Paiotti等[6]的研究显示依那西普可减轻TNBS诱导的结肠损害。本研究为TNFRⅡ-IgG在IBD中的应用提供了依据。

自Drakos等[14]第1次报道1例CD患者在骨髓移植6个月无疾病活动后，相继有类似的临床研究报道[15]。MSCs具有很强的可塑性，可分化为肠上皮细胞[16]，也可以分化为肌成纤维细胞[17]；除了多向分化的潜能外，还可分泌多种细胞因子[18]；也具有抗炎和免疫调节的作用[19]。现在还不能完全明确MSCs治疗IBD的机制，可能是通过多种机制发挥治疗作用[20]。MSCs容易分离获得，可在体外大量扩增且仍保持增殖与分化潜能。因此MSCs移植是一种十分有吸引力的治疗方式。

我们先前的研究发现在炎症环境条件下可促进MSCs增殖[21]。本研究发现应用MSCs干预后前6 d的表现跟结肠炎组大鼠无明显差异，第6天的DAI评分虽然低于结肠炎组但差异并无统计学意义。这种现象的原因不明。Tanaka等[17]在葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的结肠炎动物模型中观察到在诱导结肠炎的过程中MSCs是没有任何治疗作用的，可能是因为MSCs从注射到发挥治疗作用需要一定时间，当然也有可能是结肠炎造模时的炎症程度偏重有关。移植过MSCs的大鼠从第7天开始体质量开始增加，腹泻和便血减轻，到第14 d时大鼠一般情况良好，无腹泻和便血，大鼠肠黏膜有轻度充血，糜烂和溃疡已不可见，镜下可见肠黏膜腺体和上皮增生，结构基本恢复，少量炎症细胞浸润。研究提示MSCs起效时间比较慢，在移植2周后黏膜基本可完全恢复。

本研究首次观察到MSCs在TNBS诱导的动物结肠炎中具有剂量依赖性的干预作用，高剂量MSCs可取得更好的治疗效果。Tanaka等[17]在DSS诱导的动物结肠炎中也有类似的研究结果。与之不同的是本研究中第6天和第9天的损伤评分没有统计学意义的区别，表明高剂量的优势需要一定时间才能发挥出来。

MSCs移植后大鼠DAI、CMDI和TDI评分均低于TNFRⅡ-IgG组和美沙拉嗪组，显示MSCs移植比传统药物美沙拉嗪和新型免疫抑制剂TNFRⅡ-IgG的疗效更好，大大提高了MSCs作为难治性疾病IBD的一种高效治疗方式的可能性。

本实验表明MSCs对IBD有肯定的治疗效果，且优于传统药物美沙拉嗪和新型免疫抑制剂TNFRⅡ-IgG，同时MSCs的治疗作用还呈一定剂量-效应关系，为IBD的治疗提供了一种新选择，也为MSCs在动物结肠炎研究中剂量和时间的选择提供了一定的依据。MSCs治疗IBD的具体机制有待进一步探讨。新型免疫抑制剂TNFRⅡ-IgG也显示出显著的治疗效果，为IBD的治疗又提供了一种新的选择。

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Effectsofmesenchymalstemcells,fusionproteinoftumornecrosisfactorreceptorⅡ-IgGFcandmesalazineondiseaseactivityindexandtissuedamageindexofTNBS-inducedcolitisinrats

WU Xin-huan1, HUANG Hua-rong2, ZHONG Ying-qiang1, YE Xiao-yan1, WANG Lin3

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPediatrics,3DepartmentofPathology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:zhongyingqiang@21cn.com)

AIM: To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs), the fusion protein of tumor necrosis factor receptorⅡ-IgG Fc (TNFRⅡ-IgG) and mesalazine on the disease activity index (DAI) and tissue damage index (TDI) in the rat model of colitis induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).METHODSMSCs were cultured in low-glucose DMEM containing 10% FBS. Eighty-one Sprague-Dawley rats were used in the study and the model of colitis induced by TNBS/ethanol was established. The rats were randomly divided into 6 groups: normal control group (A), colitis group (B), MSCs treatment 1 (3×106MSCs) group (C), MSCs treatment 2 (5×106MSCs) group (D), TNFRⅡ-IgG treatment group (E) and mesalazine treatment group (F). The scores of DAI were used to record the manifestations of the rats, colon macroscopic damage index (CMDI) was used to describe the macroscopic features of the colon, and the scores of TDI were estimated by determining the pathological changes of the colon under microscope.RESULTSPure MSCs were gained by 3 times of passages. Compared with group A, the scores of DAI, CMDI and TDI in group B were always significantly increased. On day 6, these scores in every group except group A were not different obviously. On day 9, the scores in group C,group D and group F were lower than those in group B, and no statistic difference between group C and group D was observed. On day 14, the scores in group C, group D, group E and group F were lower than those in group B, and the scores in the groups were group F > group E > group C > group D.CONCLUSIONMSCs, TNFRⅡ-IgG and mesalazine used for 14 d significantly improve the scores of DAI, CMDI and TDI in the rats with colitis induced by TNBS. The method using MSCs is better than those using TNFRⅡ-IgG and mesalazine.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Tumor necrosis factor receptorⅡ-IgG Fc fusion protein; Mesalazine; Inflammatory bowel disease; Rats

R735

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.003

1000- 4718(2013)05- 0784- 06

2013- 02- 25

2013- 03- 25

中国医疗手牵手工程委员会、北京医学奖励基金会资助项目(No.XHYSGZZSDX-001);康哲IBD基金资助项目

△通讯作者 Tel: 020-81332598; E-mail: zhongyingqiang@21cn.com