杂草对乙酰乳酸合成酶抑制剂类 除草剂抗药性的研究进展

张云月， 卢宗志， 李洪鑫， 崔海兰

(1.吉林省农业科学院植物保护研究所，吉林公主岭 136100； 2.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

杂草对乙酰乳酸合成酶抑制剂类 除草剂抗药性的研究进展

张云月1， 卢宗志1， 李洪鑫1， 崔海兰2

(1.吉林省农业科学院植物保护研究所，吉林公主岭 136100； 2.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

本文针对杂草对乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂抗药性的产生历史与发展现状、抗药性机理以及抗性基因的利用进行了综述，并讨论了该类除草剂在我国应用过程中应该注意的问题以及今后的发展方向。

杂草；乙酰乳酸合成酶；抗药性机制

农田杂草是导致农作物减产的最主要原因之一，而施用化学除草剂是人们公认的防除农田杂草最有效、最经济的手段。乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂因具有生物活性高、使用量低、杀草谱广、选择性强、对哺乳动物毒性低等优点而受到人们的青睐。但是由于该类除草剂作用位点单一，杂草极易对其产生抗药性，因此抗ALS抑制剂类除草剂的生物型杂草成为发展速度最快的抗性杂草。抗性杂草问题的日益突出已经引起科学家们的极大关注，有关杂草对ALS抑制剂类除草剂抗药性的研究已有很多报道。本文对近年来国内外学者对抗ALS抑制剂杂草的发展现状、抗药性机理及抗性基因的利用等方面进行了论述。

1 ALS抑制剂的作用原理

ALS是催化支链氨基酸——缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成过程中第一阶段的关键酶[1-2]，它能够在缬氨酸和亮氨酸的合成中催化2个分子的丙酮酸生成α-乙酰乳酸和CO2，在异亮氨酸的合成中催化1个分子的丙酮酸与1个分子的α-丁酮酸生成 2-乙醛基-2-羟基丁酸和CO2[3]。ALS抑制剂类除草剂通过抑制植物体内ALS酶的活性来阻断支链氨基酸的生物合成，进而影响蛋白质的合成并抑制细胞分裂，从而导致植物组织失绿、黄化，使植物的生长发育受到抑制而逐渐死亡，最终达到化学除草的目的。目前在全球范围内应用比较广泛的ALS抑制剂类除草剂主要有磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones，IMI)、 磺酰胺羰基三唑啉酮类(sulfonylamino carbonyl triazolinones，SCT)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines，TP)、嘧啶硫代苯甲酸酯类(pyrimidinylthiobenzoates，PTB) 等[4]。

2 抗ALS抑制剂类除草剂杂草的产生与发展现状

美国杜邦公司于1982年成功研制出第一类ALS抑制剂类除草剂——磺酰脲类除草剂，自此其便开始大规模的商业化生产和应用。1987年，Mallory-Smith等报道毒莴苣对磺酰脲类除草剂产生了抗药性[5-6]，这是第一例关于抗ALS抑制剂类除草剂杂草的相关报道，从此抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型迅速发展，截至2013年3月，国际抗除草剂杂草委员会就报道已有34个国家和地区的129种杂草对一种或多种ALS抑制剂类除草剂存在抗药性，涉及禾本科、十字花科、菊科、藜科、苋科、蓼科、莎草科、石竹科、千屈菜科、泽泻科、旋花科、雨久花科等植物[7]。目前，在我国发现稻田中的雨久花(Monochoriakorsakowii)、慈姑(Sagittariasagittifolia)对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆具有抗药性[8-10]，小麦田的猪殃殃(Galiumaparine)[11]和播娘蒿(Descurainiasophia)[12-13]对苯磺隆产生了抗药性。

3 杂草对ALS抑制剂的抗药性机制

杂草对 ALS抑制剂类除草剂的抗性机理主要包括2种：第一种是基于代谢解毒能力的提高而产生的非靶标抗性；第二种是由于作用的靶标基因发生点突变或者靶标基因的过度表达而产生的靶标抗性。

3.1 基于解毒代谢功能增强的非靶标抗性

Cotterman等研究发现，抗禾草灵的瑞士黑麦草对氯磺隆具有交互抗药性，原因可能是由于氯磺隆在植物体内形成的羟基氯磺隆(hydroxyl chlorsulfuron)与葡萄糖共轭结合的能力增强，使得植物体把氯磺隆转化为无毒化合物的代谢能力有所提高[14]。鼠尾看麦娘对氯磺隆产生抗药性则是通过N-脱烃作用和细胞色素P450有联系的环形烷基氧化过程，使除草剂迅速降解而实现的[15]。稻稗对双草醚产生抗药性也是由于细胞色素P450的单加氧酶作用而引起的代谢加速所造成的[16]。耐药大豆体内快速降解氯嘧磺隆的主要代谢途径是与同源谷胱甘肽的缀合，其次是脱酯作用，2种代谢都能使ALS完全失去活性[17]。Devine认为，在除草剂的选择压力下，除草剂代谢涉及的主要代谢解毒酶类如谷胱甘肽还原酶、过氧化物歧化酶、细胞色素P450单加氧酶等含量和活性的提高都会使除草剂代谢为无毒化合物的能力加强，但是一般很难形成较高的抗性[18]。

3.2 靶标抗性

3.2.1 除草剂作用位点的改变 虽然有些杂草的抗性生物型是由于对除草剂解毒代谢能力的提高而产生的，但是在多数情况下，靶标酶基因发生点突变才是杂草产生抗性的主要原因。如ALS基因保守区中一个或者几个位点发生突变，会使ALS分子结构发生改变，从而导致靶标酶对ALS抑制剂的敏感性降低[19-22]。目前在抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型中，多数都是由6个氨基酸中的一个或几个被取代所造成的：122位的丙氨酸被酪氨酸、缬氨酸或苏氨酸所取代[23-24]；197位的脯氨酸被组氨酸、苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺所取代[25-27]；205位的丙氨酸被缬氨酸所取代[28]；376位的天冬氨酸被谷氨酸所取代[29]；574位的色氨酸被亮氨酸所取代[30]；653位的丝氨酸被苏氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸所取代[31]。这些发生突变的抗性位点都位于ALS催化亚基的保守功能域上。近年来的研究中还发现了一些新的突变位点，Sales等在研究稻田杂草红稻对咪唑乙烟酸的抗药性时发现了2个新的突变位点[32]，即Gly654突变成Glu654，Val669突变成Met669，并认为这2个位点的突变是红稻对咪唑乙烟酸产生抗药性的主要原因；Laplante等发现了5个狗尾草(Setariaviridis)抗性种群对咪唑啉酮均具有高的抗性，其中Brodhagen种群ALS的Gly654被Asp取代[31]；Massa等经过研究认为，风翦股颖(Aperaspica-venti)对SU、TP、SCT具有交互抗性是由于ALS基因中的Arg377突变成His所造成的[27]。

目前关于靶标位点氨基酸突变而产生杂草抗药性方面的报道较多，而且这些抗性能够稳定遗传，其抗性基因在克隆并导入拟南芥之后，仍然具有抗性[33]。在除草剂的选择下，杂草对ALS抑制剂类除草剂抗药性的遗传是由一个单一的、半显性或者显性的、核编码的等位基因所控制的，其遗传方式遵循孟德尔遗传规律，且该抗性基因可以通过花粉和种子进行传播[34]。

3.2.2ALS基因的过度表达 Xiao等筛选出了一个毛曼陀罗(DaturainnoxiaMill.)的抗氯磺隆生物型，经研究发现，这一生物型产生抗药性的原因是靶标酶ALS的过量表达[35]。此外，在玉米自交系中也发现了由该种机制引起的对ALS抑制剂类除草剂的抗性[36]。Boutsalis等认为，东方大蒜芥(Sisymbriumorientale)NS01种群产生抗药性不仅仅是由于ALS基因中的Trp574被Leu574替换而造成的，ALS酶的过量表达也可能引起该种群对ALS抑制剂产生抗性[22]。由于ALS基因的过度表达而产生抗药性的生物型较少，目前对这一方面的相关报道也较少。

3.3 交互抗性

不同结构的ALS抑制剂往往能够导致不同位置的氨基酸发生突变，从而对不同类别的ALS抑制剂类除草剂产生交互抗性。而抗药性程度和范围则取决于ALS上的氨基酸取代位点及种类[37]。目前报道最多的突变位点是Pro197，共有8种取代的氨基酸，是取代种类最多样的一个位点，Pro突变成这8种氨基酸中的任何一种都会使杂草对SU类除草剂产生很高的抗药性，而只有当Pro197被Leu取代时，杂草才会对IMI类抑制剂表现抗药性[38]，原因可能是由于Pro197位于ALS酶活性位点通道入口α螺旋的一端，它可以同SU类抑制剂的芳香环结合，而与IMI类抑制剂咪唑喹啉酸无直接作用，咪唑喹啉酸只结合在活性位点通道的中间位置，因此Pro197只有被分子结构较大的氨基酸残基取代才能阻碍IMI类抑制剂进入酶的活性部位。Ala122被Thr取代，Ser653被Asn、Thr取代均可使杂草对IMI类抑制剂产生很强的抗性，但对SU类抑制剂的抗性并不强；Ala122与二氢咪唑啉酮环有疏水衔接，如果替换为极性较大的氨基酸，除草剂就很难与ALS 的活性位点结合；对于SU类抑制剂，Ala122只与氯嘧磺隆结构中的乙酯取代基相互作用，而不与其他SU类抑制剂的乙酯取代基作用。当分子结构较大的氨基酸取代Ser653时，它占据了芳香环所在的空间，因此削弱了IMI类除草剂与 ALS的亲和能力。Trp574残基决定着ALS酶活性位点通道的形状，并且在SU类和IMI类抑制剂与酶的结合中起着重要作用，因此该位点发生突变能够使杂草对SU类和IMI类抑制剂均产生抗性[39]。

4 抗性基因的利用

随着植物分子生物学研究领域的展开以及杂草对除草剂抗药性机制研究的不断深入，抗除草剂转基因作物的研发和产业化得到了进一步深入。人们从由于基因突变而从对除草剂产生抗性的生物体中分离或者克隆出ALS抗性等位基因，将该基因导入植物受体细胞并整合进植物基因组中，从而获得转基因抗除草剂植物。将来自拟南芥或者烟草中发生点突变的ALS抗性等位点进行遗传转化，获得了抗ALS抑制剂的转基因玉米、小麦、水稻、油菜、向日葵、菊苣、甜菜、棉花、亚麻等作物新品种[40-42]，但是目前只有抗磺酰脲类除草剂的转基因棉花和亚麻进入了商品化种植阶段，其他品种尚处于研究阶段[21]。此外，人们还通过诱变和组织培养的方式培育出了抗咪唑啉酮玉米、油菜和甜菜[43]。

5 结语

抗ALS抑制剂杂草生物型的产生及其迅速发展已经严重威胁了该类除草剂的正常使用和生产，同时也向当今过分依赖化学除草剂的杂草治理方式提出了严峻的挑战。随着科学技术的进步和科研手段的创新，杂草抗药性机制的研究已经从生理生化和分子水平上揭示了除草剂与作用位点结合的关系以及由于位点突变而产生抗药性的分子机制。我国对杂草抗药性机制的研究起步较晚，与发达国家相比较为滞后，特别是对由于靶标酶基因发生突变而引起抗药性杂草的相关报道相对较少，而对抗药性杂草分子机制的研究又尤为重要。因此在抗药性杂草研究方面，我国应该针对当前的杂草抗药性发展现状，合理借鉴国外的先进理念和技术，从分子生物学角度深入研究杂草产生抗药性的原因，剖析靶标酶内部的基因变化，明确基因突变的发生位点，为抗药性育种提供良好的种质资源及基因资源，同时也为除草剂分子设计与发展提供更广阔的空间，并对如何科学地使用和保护该类除草剂以治理抗性杂草，以及开发新型抑制剂类除草剂提供理论基础，从而建立一套可持续发展的杂草管理方案。

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ResearchProgressonWeedResistancetoAcetolactateSynthaseInhibitors

ZHANG Yun-yue1， LU Zong-zhi1， LI Hong-xin1， CUI Hai-lan2

1.Institute of Plant Protection，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling 136100，China；2.Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China)

This paper summarizes the development，history，current situation，and mechanisms of resistance to acetolactate synthase(ALS) inhibiting herbicides as well as the use of resistance genes. Problems associated with the use of this herbicides in China and further developments are also discussed.

weeds；acetolactate synthase(ALS)；herbicide-resistance mechanism

S451.2

A

1003-935X(2013)02-0001-05

张云月，卢宗志，李洪鑫，等. 杂草对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗药性的研究进展[J]. 杂草科学，2013，31(2)：1-5.

2013-04-27

国家“十二五”科技支撑计划重大项目(编号：2012BAD19B02)。

张云月(1985—)，女，硕士，主要从事农田杂草抗药性机理研究。E-mail：hettyzyy@163.com。

卢宗志，男，博士，副研究员，主要从事农田杂草研究。Tel：(0434)6283179；E-mail：luzongzhi1969@163.com。