正交设计优化唇形科植物ITS反应体系

沈文华，陈 业，李娅迪，江 辉，关 萍

(贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025)

唇形科(Lamiaceae)是双子叶植物纲中的一个大科，大约有220属3 500余种，中国约有98属800余种，全国广布;贵州有47属127种［1］。中国唇形科药用植物共有74属345余种，其中《中药大辞典》收录的共41属120余种［2］，常见的唇形科药用植物有益母草、牛至、夏枯草、筋骨草、藿香、紫苏、薄荷、荆芥、黄芩等［3］。唇形科植物只有在花果期时才便于鉴定，且属内不同种相似性较大，种质鉴定极其不易，作为药材时，经常有奸商将伪品鱼目混珠［4］。DNA条形码(DNA barcoding)作为一种快速、有效而标准化的分子鉴定方法，由加拿大U-niversity of Guelph动物学家Paul Hebert首次提出［5］。Kress等［6］最早将 ITS 作为植物 DNA 条形码候选片段，目前已有在七叶一枝花［7］、柴胡［8］、黄草石斛［9］等中药材方面的研究。本文对常见唇形科植物ITS-PCR反应体系进行了优化，旨在为唇形科药用植物的分子鉴定奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的16种唇形科植物均于2012年6月至9月采于贵阳市花溪区，由贵州大学生命科学学院关萍教授鉴定(表现1)。

1.2 基因组DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法［10］提取全基因组DNA，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，通过紫外分光光度计确定DNA浓度与纯度，并将浓度稀释至20～80 ng/μL。

表1 研究材料Tab.1 The materials used for PCR reaction system optimization

1.3 正交设计与各反应因素水平确定

益母草nrDNA ITS片段的扩增采用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)［11］。以益母草DNA为模板，选用L9(34)正交表(表2)，对Taq聚合酶、Mg2+、dNTP及引物的浓度进行筛选。反应体系总体积为25μL，每管加入2.5μL的10×PCR buffer和1μL模板DNA，加去离子水补足，每组处理重复两次。

表2 PCR正交试验设计表［L 9(34)］Tab.2 Orthogonal design for PCR amplification

PCR扩增反应在Bio-Rad梯度PCR扩增仪上进行，反应程序为:94℃ 4 min;94℃ 1 min;54℃45 s;72℃ 1 min;35次循环;72℃最后延伸7 min，扩增完成后4℃保存。用1.5%的琼脂糖凝胶成像系统成像。

依据桂腾琴等［12］的方法对PCR扩增结果依次打分，采用正交设计助手ⅡV3.1与MINITAB软件对试验进行直观分析与分差分析，依据方差分析的结果确定是否需要进行多重比较分析。

根据试验分析结果，选择最佳反应体系对退火温度进行梯度试验，设定 50.0、50.7、51.9、53.6、55.6、57.2、58.4、59.0℃8 个温度梯度，每个梯度设两个重复，最后用最佳反应体系与程序对16种唇形科植物进行ITS-PCR稳定性验证。

2 结果与分析

2.1 ITS－PCR正交设计直观分析

正交试验PCR产物电泳结果见图1。综合考虑两次重复的扩增结果，条带最清晰、稳定的组合计9分，最差的计1分，9个组合的分数依次为3、4、8、5、6、9、2、1、7，再根据打分，采用正交设计助手ⅡV3.1进行直观分析(表3)。极差值R反应了影响因素对反应体系的影响，R越大，影响越显著。由表3可知，各因素水平的变化对反应体系的影响从大到小依次为:Mg2+＞Taq＞dNTP＞引物。

图1 正交试验PCR产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis of orthogonal design PCR products The codes of lane

表3 正交设计直观分析Tab.3 Intuitive analysis of orthogonal design

依据每个因素水平下的均值ki，直观分析得出的最佳反应体系为:1.5 U Taq聚合酶;2.0 mmol/L Mg2+;0.15 ～0.20 mmol/L dNTP;引物浓度为 0.4 μmol/L。直观分析得出的最佳反应体系并没有在正交表中表现出，虽然与得分最高的6号组合在引物用量上有差别，但其ki值相差并不是很大。

2.2 正交设计方差分析

用正交设计助手ⅡV3.1软件对试验结果进行方差分析(表4)。由F比值可知，Mg2+浓度各水平对PCR结果的影响最大，其次是Taq聚合酶用量，而dNTP与引物量对PCR结果影响不明显。

表4 正交设计方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal design

用MINITAB软件对试验结果进行多重比较分析(图2)，结果表明，Mg2+浓度对该试验结果的影响最大。Mg2+浓度在 1.0、1.5 mmol/L 水平间的差异不明显，但与2.0 mmol/L水平的差异显著(图2)。图 1 中，当 Mg2+浓度为1.0 mmol/L(1、4、7 号处理)时和1.5 mmol/L(2、5、8 号处理)时，临近处理号PCR产物条带相似，扩增条带弱、有杂带，且弥散、拖尾;当 Mg2+浓度为 2.0 mmol/L(3、6、9 号处理)时，扩增条带亮度清晰、明亮，无杂带，弥散与拖尾现象减弱或者消失。因此，选择2.0 mmol/L为最佳水平。

Taq聚合酶用量对PCR结果的影响仅次于Mg2+用量，各水平间均有显著差异，说明在本试验所选梯度范围内Taq聚合酶用量对PCR反应结果影响较大，最佳用量为1.5 U。

dNTP浓度在该试验选取的3个水平范围内对PCR扩增结果影响不显著，这一结论与马大龙等［13］的研究相似，参照ki值以及从经济角度考虑，最佳dNTP浓度为0.15 mmol/L。

在本试验所选的3个水平范围内，引物浓度对PCR扩增结果的影响也不显著，这与陈业等［14］的研究相似，参照每一因素水平下的数据平均值ki，最佳引物浓度为1.0μmol/L。

图2 各因素与实验结果主效应图Fig.2 The main effect pattern of each factor and experiment result

2.3 退火温度对益母草ITS－PCR扩增的影响

根据正交试验结果，选择的反应体系为:1.5 U Taq 聚合酶，2.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.4μmol/L引物。依据引物Tm值，以此体系进行温度梯度试验(图3)。由图3可见，退火温度较高时(55.6、57.2、58.4、59℃)，扩增条带较弱，且杂带较多;退火温度较低时(50℃)，扩增条带虽然清晰、明亮，但主带附近有1条明显的杂带;退火温度50.7～53.6℃都能扩增出单一明亮的条带。由于适当提高退火温度可提高扩增产物的特异性，故选择53.6℃为最佳退火温度。

图3 退火温度对ITS反应的影响Fig.3 The effect of annealing temperature on ITSamplification Lane 1 to 8 indicating the annealing temperature

2.4 最佳反应体系和反应程序的验证

根据正交试验及温度梯度扩增试验结果，对唇形科16种植物进行反应体系的验证。反应程序为:第一阶段，94℃预变性4 min;第二阶段，94℃变性 1 min，53.6℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循环 35次;第三阶段，72℃延伸7 min，反应终止，4℃保存。PCR扩增后进行电泳检测出现清晰、明亮的单一谱带(图4)，产物经上海生工测序，除10以外都获得了ITS序列。

图4 16种常见唇形科植物ITS扩增结果Fig.4 Electrophoresis of 16 common lamiaceae PCR products

3 讨论

已有研究报道［10-12］表明，PCR反应对模板浓度要求范围较宽，故本试验未对模板浓度进行探究。试验结果表明，在ITS扩增反应体系中，Taq聚合酶、Mg2+对扩增结果有重要影响，而dNTP、引物浓度对扩增结果的影响不明显。在PCR反应体系中，Mg2+浓度过高，会使反应特异性降低，浓度过低，使产物产量减少;Taq聚合酶浓度太高，会出现非特异性扩增，而过低时则扩增产量太低。同时，为增加试验的可比性，应尽量选择同一产家同一批次的Taq聚合酶。dNTP与引物浓度对PCR扩增结果都有影响，dNTP浓度过低影响扩增产量，过高则会导致错误掺入，而引物浓度过高则有两个弊端:一是容易形成引物二聚体，二是微量靶目标并且起始材料又不太纯时容易产生非特异性产物。本试验dNTP与引物浓度的3个水平对扩增结果影响不明显，仅表明这3个水平对本试验的影响。因此，不同植物初建ITS-PCR体系时，要保证扩增结果的稳定性、可信性、重复性，必须对ITS扩增的条件与因素进行优化。

本试验将正交设计应用于PCR反应体系的优化中，并在结果分析中应用了正交设计助手、MINITAB软件。与单因素设计和完全组合设计相比具有以下优势:减少了处理组合，节省了人力财力;将结果量化，使结果更标准、完善、科学，具有一定的客观准确性;试验中各因素内水平间的相关性分析结合图表，其规律一目了然。本试验中对正交试验结果打分带有一定的主观性，打分结果可能出现因人而异的情况，因此，可采取多次打分取平均值的方法以削弱误差的影响，同时需建立一套客观、标准的评价准则。

本试验获得的最佳反应体系经过论证，可以为后续唇形科植物ITS-PCR反应提供参考。对于样品10，可以适当提高Mg2+浓度，或者结合单因素试验对Mg2+浓度进行优化，以获得ITS序列。

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