沙丁胺醇多克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

张书杰，雷雅静，徐晓倩，施卫星，陈枢青

(1.浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所，浙江杭州310058;2.浙江大学医学院公共卫生学院，浙江杭州310058)

沙丁胺醇(salb utamol，SAL)又名咳喘宁，化学名1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，是一种选择性短效β2-受体激动剂，临床上用于平喘药。添加微量SAL于动物饲料中，可以增加牲畜的瘦肉量，减少脂肪量，但其毒性远高于具有相同功能的物质。近年来由于利益驱使，造成SAL的滥用，使得食品安全事件频发，这严重威胁着人们的生命安全和健康［1］。因此，SAL残留检测问题一直受到人们的广泛关注。目前，国内外文献报道关于SAL残留检测的方法有很多，主要有HPLC、GC-MS、GC、MS-MS、薄层色谱法、酶联免疫吸附法等;其中，酶联免疫吸附检测(ELISA)因其快速、灵敏、特异性强等优点已逐渐成为环境污染小分子快速检测的主要方法之一［2］。而此类试剂盒目前主要依赖进口，价格昂贵，因此建立快速、灵敏的ELISA检测方法很有必要。本研究通过制备沙丁胺醇多克隆抗体，建立了间接ELISA检测SAL浓度的方法，为开发快速、灵敏的ELISA试剂盒奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料 沙丁胺醇购于美国SIGMA;克伦特罗购于美国 SIGMA;沙丁胺醇人工抗原(SAL-OVA)购于珠海英平生物科技有限公司;弗氏完全佐剂CFA购于美国SIGMA;弗氏不完全佐剂IFA购于美国SIGMA;对氨基苯甲酸、亚硝酸钠、氢氧化钠和盐酸均购于阿拉丁试剂;新西兰大白兔(雄)购于浙江大学动物实验中心;辣根过氧化物酶标记羊抗兔lgG抗体购于武汉博士德生物工程有限公司;酶标仪(BIO-RAD Model 680)购于北京成志科为生物科技公司。

1.2 溶液的配制 磷酸盐缓冲液(PBS)、包被液、底物缓冲液、终止液、显色液按文献［3］中的方法配制。

1.3 包被原(SAL-OVA)的合成

1.3.1 重氮化法［4］合成SAL衍生物 将2.5 mmol对氨基苯甲酸溶于5 ml、5%NaOH溶液中，4℃搅拌预冷。3 mmol的NaNO2(溶于3 ml水)与7.5 mmol HCl溶液(质量分数为12%)混合后，逐滴滴加到对氨基苯甲酸溶液中，0℃～4℃反应至KI-淀粉试纸变蓝后，加少量尿素中止反应。

将2.5 mmol的沙丁胺醇溶于1.5 ml、10%NaOH溶液中，4℃搅拌预冷，将上述得到的重氮化溶液逐滴滴加到上述溶液中，反应30 min，得到棕黄色的浑浊液，抽滤后得到棕黄色沉淀，用1∶1的水和乙醇溶液重结晶，得到比较纯的沙丁胺醇衍生物，TLC点板显示含有少量的沙丁胺醇，可以用于后续实验。

1.3.2 SAL-OVA的合成 按照EDC/NHS法［5］，将鸡卵清蛋白(OVA)与沙丁胺醇衍生物偶联，透析完全后得到SAL-OVA。SAL-OVA溶液为浅黄色，经紫外扫描分析证明偶联成功，估算偶联比为15∶1。

1.4 多克隆抗体的制备 选取2组(每组2只)体重大约2 kg的新西兰雄性大白兔，采取背部皮下多点注射的方式进行免疫。基础免疫时，取一定量的 DES-HS-BSA溶液与等量的CFA(弗氏完全佐剂)混匀乳化，直至形成乳白色的油包水型乳浊液，然后进行注射。间隔一定时间后进行加强免疫(佐剂为IFA)。第2次加强免疫开始7 d后，取耳缘静脉血，测血清效价，直到效价不再升高，最后一次采用颈动脉取血，离心得到血清。

免疫剂量:一组兔子是100 μg，加强免疫的时间间隔为一周;另一组兔子是50 μg，加强免疫的时间间隔为2个月(小剂量长周期)，加强免疫5次［6］。比较两组兔子抗血清的效价，取效价高、特异性好的血清，采用辛酸-硫酸铵法［7］纯化，将得到的多克隆抗体加入一定比例的甘油，置-20℃保存。

1.5 间接ELISA反应条件的优化［8-10］

1.5.1 包被缓冲液的选择 分别以pH 9.6碳酸盐缓冲液(CBS)、pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)及蒸馏水作为包被液，每种缓冲液分别包被2块96孔板，将包被好的板子分别于4℃过夜、37℃ 2 h包被，按照文献中ELISA流程进行操作，测定450 nm处的OD值，选择最佳包被条件。

1.5.2 封闭液的选择 选择1%BSA、5%脱脂奶粉做封闭液和不加任何封闭液，进行ELISA实验，根据OD值选择最佳封闭液。

1.5.3 封闭条件的选择 4℃封闭过夜、37℃封闭1.5 h、37℃封闭45 min分别进行ELISA实验，选择最佳的封闭条件。

1.5.4 酶标二抗浓度的选择 将HRP-羊抗兔lgG 分别作 1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 和 1∶6 000倍稀释，ELISA测其OD值，选择最合适的酶标二抗浓度。

1.5.5 最佳显色时间的选择 选择5 min、10 min和15 min做为显色时间，根据OD值确定最佳显色时间。

1.6 抗原抗体最佳工作浓度的确定［11］采用棋盘法确定抗体抗原最佳工作浓度。将兔血清按照 1∶800、1∶1 600…1∶6 400…做倍比稀释，包被原溶液稀释为 1.5 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml及 0 μg/ml，进行间接 ELISA 实验。选择OD值在1.0左右，空白吸收值小，抗原抗体用量最少的浓度，大致确定抗原抗体浓度，然后进一步优化抗原和抗体的工作浓度。以上步骤确定的最佳包被浓度作为抗原的包被浓度，用间接ELISA方法测定抗血清的效价。

1.7 抗体的特异性［12-13］将包被原抗体稀释到最佳工作浓度，标准品(沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、己烯雌酚、去甲肾上腺素)稀释成1 000 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0 ng/ml，标准品与抗血清同时加入，做间接竞争ELISA实验。计算抗体对小分子的IC50以及与其他小分子的交叉反应率，交叉反应率=IC50SAL/IC50对照×100%。

1.8 间接ELISA方法的建立［14-16］

1.8.1 标准曲线的建立 称取SAL标准品10 mg，溶于1 ml甲醇溶液中制备SAL储备液，放在4℃冰箱中备用。将储备液稀释成1 000 ng/ml、100 ng/ml、20 ng/ml、15 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml、0.1 ng/ml及 0 ng/ml系列质量浓度。用优化好的间接竞争ELISA方法检测，得到OD450，计算各质量浓度所对应的抑制率I=B/B0×100%(B0对应0 ng/ml的 OD 值)，以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标做标准曲线。

1.8.2 方法的精密度 选择3个标准SAL质量浓度(8 ng/ml、12 ng/ml和 16 ng/ml)，将每个浓度重复测定3次，计算变异系数(CV)。

1.8.3 回收率 将人尿样在3 500 min-1条件下离心10 min，得到澄清的尿样。取一定体积的尿样，分别添加一定浓度的SAL标准品，使其终质量浓度为5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml，每个浓度设3个重复，用已建立的间接ELISA方法进行回收试验，计算回收率，回收率=实际测定的浓度/添加的浓度×100%。

1.8.4 样本的分析 随机抽取50个正常人的尿样作为样本，每个样品设3个复空，用已经建立好的间接ELISA方法检测SAL浓度。

2 结果与分析

2.1 间接ELISA反应条件的优化

2.1.1 包被缓冲液的选择 棋盘法滴度结果显示，pH 9.6的碳酸盐缓冲液在做包被液时，阳性血清平均OD值最高，空白对照、阴性对照值最低，因此最佳包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

2.1.2 封闭液的选择 本实验结果显示，1%BSA与5%脱脂奶粉作为封闭液P/N没有明显的差别，但均高于不封闭的情况，由于BSA价格较贵，故选择5%脱脂奶粉做为最佳封闭液。

2.1.3 封闭条件的选择 本实验结果显示，4℃封闭过夜与37℃封闭1.5 h结果没有明显差别，但37℃封闭45 min的阴性对照明显高于另外两种情况，考虑到ELISA快速检测的特性，故选择37℃封闭1.5 h作为最佳封闭条件。

2.1.4 酶标二抗浓度的选择 HRP-羊抗兔lgG稀释1∶5 000倍时，OD值接近1.0的数值与其他稀释倍数相比较多，且阴性值比稀释倍数为1∶3 000和1∶4 000时低，故选择1∶5 000作为酶标二抗的稀释浓度。

2.1.5 最佳显色时间的选择 显色15 min时，颜色发生改变显色，5 min时总体OD值偏小，故选择10 min作为最佳显色时间。

2.2 抗原抗体最佳工作浓度的确定 棋盘法滴度结果显示，SAL-OVA最佳包被质量浓度为1 μg/ml，沙丁胺醇多克隆抗体最佳稀释度为1∶25 600。

2.3 抗体的效价 以第5次免疫得到的血清作为抗血清，在优化好的条件下测定抗体效价(图1)，P/N值≥2.1时，抗体对应的最高稀释浓度为 1∶102 400，抗体的效价可达 1∶102 400。

图1 抗血清滴度曲线Fig.1 The curve of antiserum titer

2.4 抗体的特异性 由表1可知，沙丁胺醇与盐酸克伦特罗有较强的交叉反应，交叉反应率可达97.21%，与其他相似的小分子交叉反应率﹤0.10%。

表1 抗血清的IC50以及与其他小分子的交叉反应率Table 1 The IC50of antiserum and the crossreactivity ratio with other small molecules

2.5 间接ELISA方法的建立

2.5.1 标准曲线的建立 在优化好的条件下，用间接ELISA法检测SAL浓度，以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制标准曲线(图2)，抗血清的 IC50为12.21 ng/ml，最低检测线为2.24 ng/ml。

图2 间接ELISA方法检测SAL浓度的标准曲线Fig.2 The standard curve of SAL detected by ic-ELISA

2.5.2 方法的精密度 选择3个SAL标准浓度(8 ng/ml、12 ng/ml、16 ng/ml)，将每个浓度反复测定3次，计算CV。SAL质量浓度为8 ng/ml、12 ng/ml、16 ng/ml所对应的 CV 分别为2.57、1.98、2.45，其平均 CV 为 2.33。CV ﹤3%符合方法要求的精密度。

2.5.3 回收率 用已建立的间接ELISA方法进行回收试验，计算回收率，SAL添加质量浓度5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml所对应的回收率分别为(102.62±2.30)%、(95.85±3.70)%和(98.12±2.50)%。尿液中样品的回收率在95% ～105%之间，证明了检测方法的可靠性。

2.5.4 样本的分析 随机抽取50个正常人的尿样作为样本，用以上已经建立好的间接ELISA方法检测SAL质量浓度，检出质量浓度范围为:ND～30.21 ng/ml，平均质量浓度为6.42 ng/ml，检出率为41.40%。

3 讨论

3.1 不同的免疫方式对多克隆抗体制备的影响 小分子沙丁胺醇由于结构简单，分子量小，直接免疫不能刺激机体产生抗体，因此需要与大分子载体结合，形成具有免疫原性的人工抗原，才能诱发机体产生抗体。制备多抗的过程比较复杂，通常需要使用佐剂，并且需要弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂联合使用，才能获得比较理想的多克隆抗体。另外，免疫剂量和免疫周期对多抗的制备也会有影响，本实验通过考察不同的免疫方式对多克隆抗体制备的影响，发现小剂量长周期的免疫方式获得的多克隆抗体效价更高，特异性更好。

3.2 建立间接ELISA的检测方法 目前，国内外文献报道关于SAL残留检测的方法主要有理化方法和免疫学方法，其中酶联免疫吸附检测(ELISA)方法是一种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测方法。由于ELISA的试剂比较稳定、易于保存、操作简单等因素，可用于大批样本的筛选以及定量分析。目前，许多商品化的试剂盒也已经面市。ELISA的检测过程受很多因素的影响，例如反应时间和温度、反应pH、抗原和抗体的稀释度等，本研究对影响ELISA检测的因素如包被条件、反应时间和温度、抗原抗体稀释度等进行了优化，在优化的基础上，检测一系列SAL标准品，绘制标准曲线，建立了SAL间接ELISA检测方法，检测线可达2.24 ng/ml，并对方法的灵敏性和精确度进行了考察，结果显示方法具有较好的可靠性，利用建立好的间接ELISA检测方法对人的尿样进行筛选，具有较好的实用性，为进一步开发商品化的试剂盒打下了良好的基础。“瘦肉精”是盐酸克伦特罗、沙丁胺醇等β-肾上腺激动剂类药物的俗称。本研究所建立的ELISA方法在检测盐酸克伦特罗时，有很高的的交叉反应率。同时发现，SAL在人尿中的检出率可达100%，这说明小分子环境污染物的污染问题相当严重，导致其在人体内大量残留，严重威胁着人们的健康。

本研究所建立的ELISA方法，可以直接检测尿样，取样方便，对人体没有损害，可以用于临床上大规模的体检排查。对监控和改善人们的生活环境，提高人们的生活质量具有深远的意义。

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