促红细胞生成素的神经保护作用

刘 欣，吴海琴 综述

(西安交通大学第二附属医院神经内科，陕西 西安 710004)

促红细胞生成素(Erthropoietin，EPO)是由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌的一种激素样物质，因其影响造血系统使红细胞增多被人们广泛认识并应用于临床。近年来大量研究结果证实，EPO 是一种多功能营养因子，功能性的EPO 受体在许多组织和器官中都有表达，包括神经系统的神经细胞、胶质细胞和血管内皮细胞，而且对神经系统具有重要保护作用。作者主要对EPO 的神经保护作用及其作用机制进行总结，并且对其未来在神经系统的临床应用进行展望。

1 EPO 及EPO-R(erythropoietin receptor)的结构性质及在神经系统的分布

EPO 是一种糖蛋白，相对分子质量约34×103，含有2个二硫键，一个碳末端的精氨酸残基，其编码基因定位于染色体7q21-q22，包含5个外显子和4个内含子，有4个糖基化点。EPO-R 属于细胞因子受体超家族成员，分子量为66kDa，由507个氨基酸组成的I 型跨膜糖蛋白，包括胞外区、跨膜区和胞内区。其中胞外区具有与其在细胞表面正确折叠和表达所必须的WSXWS 序列以及两对半胱氨酸残基，是与EPO 结合的区域，胞内区具有2个保守的区域Box1 和Box2，对于EPO 与其受体结合有重要作用。EPO 在这两个区域的作用下激活酪氨酸激酶-2 (janus tyrosine kinase 2，Jak2)，从而激活一系列激酶和信号转导蛋白而发挥生物学作用。

EPO 主要分布于循环血液中，是调节红细胞生成的主要因子。近年来研究发现EPO 及其受体(EPO-R)除分布于循环血液中外，在人和啮齿类动物的大脑中也广泛存在。Masuda［1］第一次证明EPO 受体存在于两种神经来源的啮齿类细胞系PC12 细胞和SN6 细胞中，同时他们［2］也证实了在试管内星形胶质细胞可以产生EPO，特别是在缺氧的状态下更明显。事实上，除肝和肾(分别为胎儿和成人主要的EPO 产生部位)外，已发现［3］另外两个可以产生EPO 的部位:子宫和脑。在神经发育过程中，应该是在神经管中最先发现EPO 受体的存在，而且在中枢神经系统(CNS)中EPO 及EPO-R 的表达随着妊娠时间的增加而发生变化，出生后及成年人脑中发现EPO 及EPO 受体不仅在神经元及星形胶质细胞中表达，同时也存在于其它细胞，如Cajal-Retzius 细胞和脉络丛细胞，而且成年人脑中EPO 的量比造血组织中低30 倍［4］。最近，Shink，Kato 等［5］研究发现，在无神经元的情况下，缺氧可以导致星形胶质细胞介导EPO 的mRNA 水平的表达，而且这与少突先驱胶质细胞也存在着密切的关系。这些都表明EPO 在神经发育及维持脑的稳态中有重要作用。

2 EPO 的神经保护作用

目前，大量体内外实验已经证实，EPO 具有神经营养及神经保护作用。有研究表明［6］在细胞及动物水平上，EPO 具有逆转抗神经节苷脂抗体(Anti-ganglioside antibodies，Abs)的抑制神经细胞重建的作用。为了测定EPO 的潜在治疗作用，Mausberg 等［7］对试验性自身免疫神经炎(experiment autoimmune neuritis，EAN)，例如吉兰-巴雷综合征 (Guillain-Barré syndrome，GBS)的动物模型进行EPO 干预发现，EPO 可以降低GBS 的严重程度及缩短疾病恢复的时间。这种神经保护及神经修复作用使得EPO 有望成为治疗自身免疫神经炎病，例如GBS 的有效药物。

同时，有大量研究证实，EPO 在缺血缺氧模型中有重要的神经保护作用。Chen 等［8］在小鼠脑缺血模型中观察并证实，脑缺血导致小鼠学习记忆力下降，海马CA1 区神经元迟发型死亡和树突棘丢失。通过EPO 治疗能显著提高脑缺血小鼠的学习记忆能力，减少脑缺血所致的海马CA1 区神经元死亡和树突棘丢失。Sargin 等［9］在转基因小鼠模型上证明，在皮质及海马神经元上持续地激活EPO-R 的表达，可以增强小鼠的认知功能。还有人［10］在兔蛛网膜下腔出血模型中观察到，EPO 可以增加海马正常神经元的密度以及阻止蛛网膜下腔出血所导致的脑血管痉挛和神经元损伤。在大鼠脑缺血再灌注损伤的模型中［11］，EPO 干预可以改善神经功能评分，增多神经细胞存活数量，减轻损伤程度，对缺血侧皮层的神经细胞变性坏死有保护作用。

此外，转基因实验结果表明［12］，突触核蛋白转基因小鼠暴露于3-硝基丙酸所致的多系统萎缩的模型中，EPO 治疗可以保护多巴胺和纹状体氨基丁酸投射区神经元，从而改善运动功能。在大鼠脊髓损伤的模型中［13］，EPO 的介入可以通过阻止神经元凋亡而保护神经元，从而抵制谷氨酸对神经元的毒性作用。有学者在创伤性脑损伤的模型中［14］发现，腹腔注射5000IU/kg 的EPO 1天或者3天都能降低海马细胞丢失，增强损伤的皮质及海马的血管再生，最重要的是改善神经功能，但是这种改善在腹腔注射3天这一组更明显，提示3 倍量的EPO延缓给药更能改善组织学和功能预后。还有学者［15］在大鼠癫痫模型上证明，EPO 可以调节癫痫的严重程度，保护癫痫大鼠海马神经元，而且在大鼠帕金森模型上［16］也证实持续低剂量输入EPO 可以发挥神经保护作用。最近，Wu［17］等建立大鼠衰老模型，探讨EPO 是否具有抗衰老作用，结果发现，中剂量的EPO 具有抗衰老作用，其作用机制可能与增强抗氧化酶活性、提高抗氧化能力有关。从以上我们可以看出，EPO 对于神经系统的保护作用是多方面的，在各种动物模型上已经证实了EPO 的重要作用，提示EPO 有可能成为治疗神经系统疾病的有效药物，对于后期的临床研究有重要意义。

3 EPO 的神经保护作用机制

EPO 的神经保护作用是通过多种途径实现的。大量研究显示，EPO 通过发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡、刺激新生血管生成、调节神经元生成等发挥神经保护作用，而这些功能的发挥依赖EPO/EPO-R 的信号转导，如图1 所示［18］。该机制认为，EPO-R 介导的EPO 生物学效应的发挥，依赖EPO 与EPO-R 结合后EPO 诱导Jak2 磷酸化，磷酸化后的Jak2 通过激活信号转导子及转录激活子STAT5 通路、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinostid 3-kinase，PI3K)/AKT 通路、核因子NF-ΚB(nuclear factor，NF-ΚB)通路而发挥作用。

首先，研究发现，Jak2-STAT5 通路是EPO实现抗炎抗凋亡作用的重要通路。Zhang 等［19］通过对脑缺血后大鼠海马CA1 区的STAT5 的观察发现，脑缺血模型中，EPO组的磷酸化的STAT5 增加，而且海马CA1 区的神经元凋亡减弱，但当加入Jak2 抑制剂后，这些作用被削弱了，这表明EPO 确实通过Jak2-STAT5 通路来发挥神经元抗凋亡作用。然而Sola 等［20］对闭塞大脑中动脉的7天龄大鼠的局灶性脑缺血模型观察发现EPO 可以诱导使磷酸化的Jak2 及STAT5 明显增多，而且Bcl-XL 的表达在脑缺血后1天也明显上调，他们发现STAT5 进入胞核后通过刺激Bcl-2 和Bcl-XL 抗凋亡基因转录，产生大量Bcl-2 和Bcl-XL 抗凋亡蛋白，从而阻止细胞色素C 从线粒体释放，发挥抗凋亡作用，提示EPO 发挥其抗凋亡作用并不是通过某一条通路作用而实现的。Um 等［21］对神经母细胞瘤细胞的凋亡模型的EPO-R 通路进行观察得到，在造血细胞，激活STAT5、AKT、MAPK 及其它通路中的任意一条即可以使细胞存活，但是EPO 在发挥神经元抗凋亡作用时，必须共同激活STAT5、PI3K/AKT 及其它通路才能发挥作用，这表明比起造血细胞，对于神经元来说，EPO 的这些功能更显得重要。

同时表明，EPO 的抗凋亡机制是多通路多途径的且这些通路之间可能存在交叉对话。

最近，Gen 等［22］证实，外源性的EPO 可以诱使Nrf2 向核内转移同时上调HO-1 的表达，而在加入MAPKs 和PI3K 的抑制剂后，这种作用被消弱了，提示可能是通过激活PI3K、MAPK和Nrf2 通路从而诱使HO-1 表达来发挥神经保护作用的。Zhang 等［23］体外培养皮层神经元建立缺氧缺糖模型，3 h 后进行再灌注，发现HIF-1α 及VEGF 在4 h 时开始升高，并在8 h 时达到高峰。同时p-AKT 也升高并在4 h 时达到高峰，早于HIF-1α 的表达。再用PI3K/AKT 通路的抑制剂青霉素做预处理后会发现，p-AKT 及HIF-1α 的表达都下降了，提示HIF-1α 可能参与PI3K/AKT 这一通路。在Aβ 所致的帕金森模型中［24］，加入PI3K 抑制剂LY294002 后，EPO 的抗凋亡作用被抑制了，同时EPO 也诱导PI3K/AKT 的下游基因GSK-3β 磷酸化，提示GSK-3β 也参与EPO 的细胞保护作用，而且在这里抗凋亡蛋白Bcl-2 也是升高的。Pregi等［25］在神经母细胞瘤细胞中加入25 ng/ml 的TNF-α 所致的凋亡模型中发现，EPO 的介入可以使抗凋亡蛋白例如Bcl-2 及NF-ΚB 的表达上调。Kim 等［26］在结扎左侧颈总动脉所致的缺血缺氧模型中，EPO 的介入可以上调Bcl-2 的表达，同时下调促凋亡基因Bax 及caspase-3 的表达，发挥抗凋亡作用，而且Bax/Bcl-2 的比例也是下降的。但是，Maier 等［27］发现在多发性硬化的模型中，EPO 所致的Bcl-2 的上调及Bax的下调并不是通过激活PI3K 引起的，而且抑制MAPK 磷酸化后Bax 及Bcl-2 的水平不受影响。Shen 等［28］发现，EPO 增强BAD 磷酸化及Bcl-x的表达与对促凋亡基因Bax 的下调是通过ERK 及AKT 通路实现的。这些提示EPO 发挥其神经保护作用的机制是复杂多样的，还需进一步的研究。

图1 EPO/EPO-R 信号转导通路示意图［18］Fig.1 Signal transduction pathway of EPO/EPO-R

4 EPO 的神经保护作用临床研究及其安全性

EPO 作为一种安全的药物应用于临床已经20 多年了，重组EPO 及各种替代品主要应用于肾脏疾病、多种原因(如恶性肿瘤放疗和严重感染)引起的恶性贫血及各种肿瘤疾病的辅助性治疗。但是随着EPO 被证实具有神经保护作用后，最近十几年，有一系列的临床试验研究了EPO 是否真的具有神经保护及再生的功能，从脑缺血、神经损伤到炎症及神经退行性变，比较欣慰的是，这些研究大多证实了EPO的治疗是有效的［29-30］。

最早的一个临床试验是Ehrenreich 等［31］研究的，该试验采用双盲对照的方法，试验组患者每天一次静脉注射3.3×104IU 的EPO，30 d后发现脑脊液中的EPO 的量是对照组的60～100 倍，提示静脉注射rhEPO 是可以到达脑部的，影像学的方法检查发现试验组的脑梗死面积缩小，且在1月后临床表现有明显的改善，这些提示静脉注射大剂量的rhEPO 对中风患者治疗是有效的。同时，Ehrenreich 等［32］通过另一项临床试验发现，对于慢性进展性的多发性硬化患者，大剂量的EPO 可改善患者的运动与认知功能，而通过对比，小剂量的EPO 并不能起到上述作用。Tseng 等［33］在对EPO 是否对动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)患者有保护作用的研究中发现，对aSAH 患者静脉注射30 000IU 的EPO 可以降低aSAH 所引起的迟发性脑缺血，并且认为这种作用可能是由于EPO 可以减轻脑血管痉挛的严重程度及缩短受损的自我调节过程所致。Abrishamkar 等［34］在一项双盲随机对照临床试验中发现，静脉注射EPO 对弥漫性轴索损伤的患者进行干预，隔天注射2000U EPO，共2 周，采用格拉斯哥昏迷评分及格拉斯哥预后评分进行评估发现，试验组患者病情恢复较对照组更早，且试验组患者的红细胞计数及红细胞比容，与对照组相比，并没有明显升高，对于弥漫性轴索损伤的患者来说，静脉注射此剂量的EPO 是比较安全的。所以说，EPO 对于神经系统疾病的治疗是有效地，但还需进一步证实。

虽然EPO 已经应用于临床多年，但是有研究表明使用EPO 的癌症或慢性肾病的病人有发生血栓栓塞并发症的危险，而且Ehrenreich等［35］在一次临床研究中发现，对急性脑缺血患者症状出现后的6 h、24 h、48 h 分别静脉注射40 000 IU 的EPO，结果发现治疗组存在安全问题，特别是对于全身溶栓的患者。最近几年，大量临床试验研究了EPO 对于新生儿神经保护作用与安全性问题。WU 等［36］发现给予新生儿缺血缺氧的患儿不同剂量的EPO，分别为250、500、1000、2500 U/kg，每48 h 一次，共6次，结果发现并没有出现不良反应或死亡的情况。但是，EPO 作为神经保护作用药物，在临床上应用于成人时其安全性问题的相关文献较少，对于成人来说，应用EPO 治疗神经系统疾病，发挥神经保护作用，其剂量及安全问题还需进一步摸索。

综上所述，EPO 作为一种神经保护剂是毋庸置疑的，作为神经系统疾病的用药有很大的应用前景，但是仍需要大量的临床研究去证实。

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