利用骨髓穿刺针建立MCF-7乳腺癌裸鼠原位移植模型*

周跃华，殷东风

(辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032)

乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内呈上升趋势，全世界每年新发病例100万，死亡约60万例［1］，是临床研究的热点之一。而乳腺癌动物模型是研究乳腺癌生物学行为及指导临床治疗的重要工具之一。因此，本研究的目的是建立人乳腺癌细胞移植模型，为研究乳腺癌打下基础。

1 材料与方法

1.1 动物

BALB/C-nu/nu雌性 SPF级裸小鼠，4～6周龄，体质量17～22g，共22只，购于上海斯莱克实验动物有限公司(许可证号 SCXK(沪)2007-0005)，饲养于SPF级条件下。

1.2 细胞

人乳腺癌细胞株MCF-7(美国标准生物品收藏中心ATCC，ER阳性)购自中国医科大学。

1.3 试剂及仪器

DMEM高糖培养液(HyClone美国);特级胎牛血清(天津灏洋生物制品);4%多聚甲醛;雌激素受体(ER)免疫组化试剂盒及DAB染色试剂盒均购于北京中山生物工程公司;骨髓穿刺针;NIKON光学显微镜(ALPHAPOT-2 YS2)。

1.4 细胞培养

MCF-7为贴壁生长细胞，培养于含有10%血清，1%青链霉素双抗的DMEM培养基中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养至对数生长期。

1.5 动物造模

1.5.1 瘤细胞悬液接种原代肿瘤 取对数生长期细胞，0.25%胰酶/EDTA消化，用细胞培养液配置成瘤细胞悬液，细胞要吹打均匀;台盼蓝染色，记录活细胞数(＞95%);计数细胞数，调节细胞浓度为1×107/ml;于每只裸鼠右侧胸壁消毒，取1ml注射器抽取瘤细胞悬液0.1ml，接种于裸鼠右侧胸壁第二乳垫下［2］，共接种2只，观察肿瘤的生长情况［3］。

1.5.2 骨髓穿刺针行瘤组织移植 当原代肿瘤长至0.8cm3大小时，手术取下肿瘤(图1)，使用骨髓穿刺针分别移植至余20只裸小鼠乳垫下:10%水合氯醛(0.02ml/10g体质量)腹腔注射麻醉荷瘤裸鼠，无菌条件下取出乳腺癌组织立即放入DMEM培养液中(图2)，剪切成1mm3左右的小块，置入骨髓穿刺针中备用。接种前，用碘伏消毒健康裸鼠的右侧胸壁，于右侧胸壁第二乳垫旁开1cm平刺进针，进至乳垫下时插入针芯，将瘤组织留在乳垫下，皮肤消毒，不需要缝合伤口，腹腔一次性注射青霉素1.5万U，裸鼠继续饲养于SPF级箱中。

1.6 术后观察

观察术后裸鼠伤口愈合情况、死亡情况，隔天测量肿瘤的生长情况并记录。第30天拉颈处死荷瘤鼠，剥离肿块行病理学检查及免疫组化检测ER的表达。

2 结果

2.1 裸鼠一般状态

术后约1～2h裸鼠全部苏醒，术后24h伤口愈合，饮食及活动正常，直至实验结束裸鼠无死亡。

2.2 肿瘤生长情况

接种乳腺癌细胞后的第12天，在接种部位乳垫处可见肿瘤结节，呈圆形、椭圆形，触之质地较硬，后结节逐渐增大，越长越快，约在第20天行穿刺针瘤组织原位移植，移植后第4～5天后乳垫处即可见肿瘤生长，成瘤率100%，且形状、大小较整齐。在移植后第20天肿瘤长至9±2mm(图3)，肿瘤继续生长就会侵及皮肤，出现溃疡性坏死。

图1 手术剥离肿瘤

图2 培养液中的瘤组织

图3 穿刺针成功移植的肿瘤

2.3 病理学检查

剥离的移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状，多侵犯皮肤，其血管丰富，多见肿瘤溃疡性坏死，有的与皮肤黏连难以剥离，无淋巴结及其他脏器转移。肿块质地中等，剖面为苍白色、半透明、质实的实性区，肿瘤大者中心呈灰白色，有坏死现象。HE染色后光镜观察，肿瘤细胞大、生长旺盛，肿瘤细胞密集、排列呈团索样结构，胞质丰富、核大、核仁清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相明显，可见散在坏死灶，病理诊断为浸润性导管癌。

2.4 ER的检测结果

免疫组化(IHC)检测严格按照按试剂盒要求操作，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达，结果20只裸鼠原位移植瘤组织的检测均为阳性表达。

3 讨论

乳腺癌动物模型的建立是研究人乳腺癌的生物学特性的基础，对乳腺癌的临床治疗治疗具有重要指导意义。目前乳腺癌的研究主要分为体外实验和体内实验，而体内实验更接近临床，更真实地反映了体内治疗效果，在临床应用上更有参考价值。因此，建立适当的人乳腺癌动物模型，是研究人乳腺癌的生物学特性及临床治疗所必需的途径。

本文所选用的动物为裸小鼠，无胸腺，先天性T细胞免疫系统缺陷，缺乏免疫排斥反应，肿瘤移植后生长良好，并能保持肿瘤细胞的原有形态及生物学特性，是肿瘤研究中较为理想动物［4］。目前，人乳腺癌动物模型主要是采用瘤细胞悬液注射的方法，使用瘤组织小块手术接种的也有报道。本研究主要是使用骨髓穿刺针原位移植瘤组织小块造模，国内未见类似报道。其优势在于:首先一次性可大批造模，移植后肿瘤的形状、大小较整齐，使实验研究更具可靠性;其次操作简单安全，成功率高达，成瘤时间短、重复性好;再次不需要大量瘤细胞悬液，节约费用。瘤组织行病理学检查诊为浸润性导管癌，ER均为阳性表达，说明移植后的肿瘤细胞保持了人乳腺癌肿瘤的组织形态和免疫学特点，为临床治疗及疗效判断提供了良好的动物模型。

［1］Smigal C，Jemal A，Ward E，et al.Trends in breast cancer by race and ethnicity:update 2006［J］.CA Cancer J Clin，2006，56(3):168-183.

［2］甄林林，武正炎，范萍，等.人乳腺癌裸鼠移植模型的建立［J］.南京医科大学学报，2001，21(6):509-510.

［3］Li Zhihong，Huang Xinfu， Li Jiyou， et al. Humanbreast carcinoma xenograftsin nude mice［J］. Chinese Medical Journal，2002，115(2):222-226.

［4］伍细丕，钱林法.实验动物与肿瘤研究［M］.北京:中国医药科技出版社，2000:78-83.