应用PCR－LDR法检测乙型肝炎病毒核苷类药物耐药多基因突变位点

张时良，裴 豪＊，戴亚新，陆 炯

（1．无锡市传染病医院 检验科，江苏 无锡214005；2．东华大学，上海201600）

核苷（酸）类似物是目前临床抗病毒治疗的常用药物，但由其引起的耐药问题也日益突出。很多研究［1－3］表明，与拉米夫定耐药相关的基因突变有逆转录酶（reverse transcriptase，RT）基因区的 M204I／V／S、L180M、V173L等；与阿德福韦耐药相关的突变 位 点 有 N236T、A181V／T、I233V、V214A、Q215S、L217R等；与恩替卡韦耐药相关的突变位点有S202G／I、M250V／I／L、T184G／A／L 等；与替比夫定耐药相关的突变为M204I等。为获得一种可以快速准确地检测以上耐药突变位点的方法，本实验采用由上海东华大学提供的多重聚合酶连接反应－连接酶检测反应分型法（PCR－LDR）对50例样本进行突变位点检测分析，以验证该方法应用于临床检测的可行性。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 样本来源 2010年5月1日至31日在本院就诊并运用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者50例，其中男性33例，女性17例，年龄15至69岁，平均年龄42．83±13．47岁。

1．1．2 主要试剂和仪器 HBV DNA荧光定量试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司，引物、探针由上海东华大学合成，电泳胶、缓冲液、内参试剂均购自美国ABI公司；所用仪器为ABI 7500Real－Time PCR System，ABI PRISM 3130DNA Sequencer购自美国ABI公司。

1．1．3 引物设计 以基因库公布的981条HBV基因序列为基础，在RT区设计2对通用引物PCR1－upper，PCR1－lower 和 PCR2－upper，PCR2－lower（表1）。

1．2 方法

1．2．1 特异性寡核苷酸探针的设计 针对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦8个耐药位点的氨基酸替换形式，设计包括rtL180M、YMDD／YIDD／YVDD、rtA181V／T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtS202I、rtM250V的8条特异性检测探针（表2）。

表1 PCR引物序列

1．2．2 血清HBV DNA的抽提 按照上海科华生物工程公司试剂说明书进行。

1．2．3 反应条件 以血清提取物为模板进行PCR反应。20μl PCR反应体系含Taq酶1U，10X缓冲液2μl，2mMdNTP 2μl，2pmol／μl引物2μl，50 mM Mg2＋1．2μl。第一轮PCR模板为血清提取物2μl，引物为PCR1－upper、PCR1－lower、PCR2－upper、PCR2－lower，反应条件为95℃15min；94℃30 s，54℃30s，72℃30s，45个循环；72℃5min；第二轮10μl LDR反应体系模板为第一轮PCR产物2 μl，10X缓冲液1μl，2pmol／μl探针1μl，反应条件为94℃2min；94℃30s，55℃ 2min，15个循环。产物保存于4℃待用。

1．2．4 测序 PCR－LDR 产物使用 ABI PRISM 3130DNA Sequencer进行产物分析，样本直接测序由上海博尚技术有限公司提供技术支持。

2 结果

2．1 PCR的灵敏度和特异性 以不同HBV DNA浓度的血清提取物为模板进行PCR检测，终检浓度为103copies／ml（荧光定量试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司）。阳性样本的最终PCR产物大小与预期值相符（PCR1－upper，low引物对的扩增物为248bp，PCR2－upper，low为231bp）。

2．2 HBV野生标准株的鉴定 为避免突变探针产生非特异性的突变信号，应用直接测序法和PCRLDR法分别对HBV野生标准株分析，结果显示，野生株在目的区段未发生耐药突变（图1）。由于临床恩替卡韦耐药相关的突变位点为S202G／I、M250V／I／L、T184G／A／L，其中又以 T184G／A／L 为主［4］，本实验仅检测到1例184位点突变。

表2 探针的名称和序列

图1 HBV野生标准株LDR法结果

2．3 临床样本血清PCR产物分析 选取的50例HBV DNA血清样本中，35例样本未检测到耐药突变，8例为拉米夫定耐药突变，5例为阿德福韦耐药突变，1例为拉米夫定和阿德福韦同时耐药突变，1例恩替卡韦耐药突变病毒株。将PCR－LDR法的检测结果与直接测序法所得结果进行比对（图2），由图2可知其结果完全一致。由此可初步证实本方法的临床可行性，可用于目前HBV抗病毒治疗药物耐药的检测。

3 讨论

迄今慢性HBV感染为全球性的难题，全世界约有3．5亿人感染，预知相关的年死亡人数约为1 200 000［5］。因此针对 HBV 的抗病毒治疗受到广泛重视。随着对HBV聚合酶的结构和功能的深入认识，一些有效抑制HBV DNA复制的核苷类药物（如拉米夫定、替比夫定、阿德福韦、恩替卡韦等）逐步成为抗HBV治疗的新选择［6，7］。由于HBV聚合酶如同其他逆转录病毒的逆转录酶一样具有较高的错配倾向且缺乏校对能力，因此随着感染的持续病毒准种逐年增多［8，9］。在核苷类药物的选择压力下，耐药变异株逐渐增多，最终替代野生株成为优势株，从而导致临床耐药现象的出现。

目前临床检测HBV耐药的方法主要有直接测序发、实时荧光PCR和反向杂交法［10］。但这些方法都有其不足之处：直接测序法可以检测HBV已知和未知的突变，但对于低滴度的样本（小于104copies／ml）无法进行检测，同时小于野生株20%的低丰度耐药株序列容易被忽略，且实验过程复杂，实验周期长；实时荧光PCR不能同时检测多位点突变，应用受到限制；反向杂交法反应步骤繁杂，应用成本较高，试验周期也较长。

图2 HBV耐药株直接测序和PCR－LDR法比对结果

我们采用PCR－LDR法构建一次性检测HBV核苷类药物耐药的多个基因突变位点的检测方法，将PCR反应和LDR反应相结合，拥有PCR的高灵敏度，LDR的高特异性和测序的高精确度等优点，结果直观，操作简便、快速，方法经济实用，完全能够满足针对临床现有常用的核苷类药物治疗HBV耐药检测，为指导临床使用核苷类药物治疗乙型肝炎患者提供重要的参考依据。

［1］Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et al．Antiviral drug－resistant HBV：standardization of nomenclature and assays and recommendations for management［J］．Hepatology，2007，46：254．

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［3］徐东平，周先志．核苷（酸）类似物治疗慢性乙型肝炎耐药研究进展［J］．传染病信息，2007，20：68．

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