HSP65在结核病血清学诊断中的应用前景初探

赖允鑫，杨江龙，沙 巍，肖洋炯，曾维宏，叶薇怡，季 萍，肖和平，王 颖＊，沈 浩

（1．上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所，上海200025；2．同济大学附属上海市肺科医院，上海200433）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，M．tb）感染引起的传染病，病原菌主要通过空气经呼吸道传播。结核病是目前仅次于AIDS的第二大传染病杀手，2011年数据统计结果显示全球新发结核病患者达900万之多，死于结核病人数达140万［1］；中国是全世界结核病高负担的国家之一，2011年新增结核病人数达90－110万，仅次于印度位居世界第二。因此，结核病的国内外防控形势非常严峻。

结核病是目前临床上诊断最为复杂的疾病之一，现有诊断技术在诊断的准确性和及时性上还存在一定的不足。例如，目前在临床上常规使用的传统结核诊断方法中，痰涂片抗酸染色法（sputum smear microscopy）只有在患者痰中M．tb含量很高的时候才能检测为阳性，因此很容易出现假阴性；痰结核菌培养法（sputum culture test）能提供更高的准确性，被誉为结核病诊断的“金标准”，但此法周期长（三周至两个月），培养成功率不高，可能延误治疗；胸部X射线只能检测出肺部病变严重的患者（如空洞），而且常常与肿瘤相混淆；基于迟发型超敏反应的PPD皮试试验则由于受检者接种过BCG而出现假阳性，也很难区分潜伏感染和活动期结核病。上述传统诊断方法的缺陷，使建立可靠高效的TB诊断新技术成为临床上的迫切需要。

血清学诊断是目前临床诊断中应用最为广泛的方法之一，该方法具有操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器等优势，并可以发展成自动化检测，在肿瘤、自身免疫病、心血管系统疾病、感染性疾病中具有广泛的运用。在结核病的血清学诊断方面，国内临床上使用针对38kDa、16kDa和LAM 3种抗原的血清学应答水平作为结核病的辅助诊断指标［4，5］，但是其检测的准确性和灵敏度还有待于进一步提高。事实上，世界卫生组织（WHO）在对68项有关商业化血清学试剂盒的研究作出评估后，发现这些试剂盒在灵敏度和特异性方面与结核病的临床诊断还有一定差距［2］，因此，寻找新的可用于结核病临床诊断的血清学标志物仍然是结核病研究热点之一。

我们利用实验室自行构建和表达的系列结核分枝杆菌抗原蛋白，采用间接ELISA方法比较筛查了活动期结核病患者与健康对照组血浆中针对结核分枝杆菌抗原的IgG和IgM水平，发现并探讨了抗HSP65的IgG和IgM作为活动期结核病新的血清学标志物的可行性。

1 材料与方法

1．1 研究对象 本实验研究对象包括50例活动期结核患者和30例正常对照，50例活动期结核病患者血浆样本来自上海肺科医院，已签署知情同意书，临床诊断基于发病史、体检、胸部X射线、痰涂试验阳性、分枝杆菌培养阳性等标准，患者基本信息与临床病理特征见表1。30例正常对照组血浆样本来自上海市健康体检者，筛选的标准是不存在结核病史，不存在肺部感染。

表1 活动期结核病患者临床与实验室指标（n＝50）

1．2 试剂与材料 BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司，咪唑购自生工生物，Ni－NTA His－Bind Resin购自QIAGEN公司，IPTG购自碧云天，超滤管购自Millipore公司，明胶购自Sigma公司，氨苄青霉素购自Biobasic公司，HRP标记的鼠抗人IgG二抗和山羊抗人IgM二抗均购自Southern Biotech公司，鼠抗His－Tag抗体购自CST公司，抗鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司，TMB底物购自BD公司，蛋白印迹显影液购自Millipore公司。

1．3 方法

1．3．1 HSP65和38kD蛋白的表达与纯化pET23b－HSP65和 pET15b－38kD 表达质 粒购 自BEI Resources公司，测序结果表明目的基因序列与H37Rv菌株的 HSP65（Rv0440）和38kD（Rv0934）序列完全一致。采用常规方法转化BL21（DE3）PLySs后，获得BL21（DE3）PLySs－pET23b－HSP65和BL21（DE3）PLySs－pET15b－38kD 表达菌株，接种200ml LB培养基（含50μg／ml氨苄青霉素）37℃，250rpm 摇至 OD值为0．4至0．6后，加入IPTG至浓度为0．4mM，在30℃，220rpm条件下诱导3h后，7 000g离心3min，收集沉淀；用20ml细 菌 裂 解 液 （PBS－1%Triton X－100－10% 甘 油－0．5mM EDTA）重悬菌体沉淀，超声法充分裂解细菌；8 000g，4℃离心30min，取上清，经0．45μm过滤器过滤后，加入1ml Ni－NTA琼脂糖微珠，4℃旋转混合过夜；次日用含PBS－20mM咪唑缓冲液充分洗涤，离心弃上清，以去除未与Ni－NTA琼脂糖微珠结合或结合不紧密的杂蛋白；用PBS－300mM咪唑缓冲液洗脱目的蛋白；采用10%SDS－PAGE电泳检测纯化蛋白纯度，收集纯度大于95%的纯化蛋白经3kD超滤管超滤，去除咪唑等小分子；再经0．22μm过滤器浓缩过滤后，加入无菌甘油至终浓度为40%，BCA法测定浓度，并置于－80℃冰箱保存备用。

1．3．2 间接ELISA法检测血浆中抗 HSP65和38kD抗体 将纯化抗原经包被液（pH9．6碳酸盐缓冲液：15mM Na2CO3／35mM NaHCO3，）稀释至1μg／ml，每孔100μl加入平底96孔板，4℃包被过夜；PBST（PBS－0．05%Tween 20）洗涤3次后，每孔加入200μl PBS－1%明胶，37℃封闭1h；PBST洗3次后，每孔加入100μl血浆稀释液（采用1%明胶／PBST经1∶100稀释），37℃孵育1h；PBST洗涤6次后，用PBST－1%明胶缓冲液稀释的HRP－抗人IgG（1∶20 000）和IgM（1∶20 000）二抗，每孔加100μl，37℃孵育1h；PBST洗6次后，每孔加入100μl TMB底物，避光反应15min，每孔加入50μl 2NH2SO4溶液终止显色反应，测定OD450nm值。

1．3．3 蛋白印迹 采用蛋白印迹鉴定纯化抗原的纯度，纯化蛋白抗原经SDS－PAGE电泳，半干印迹至硝酸纤维素膜（NC膜）上，经TBS－5%脱脂奶粉室温封闭1h后，与经TBST－5%奶粉稀释的鼠抗His－Tag抗体（1∶2 000）4℃孵育过夜；次日，用TBST洗3次，加入经TBST－5%脱脂奶粉稀释的抗鼠IgG二抗（1∶2 000）孵育1h，TBST漂洗3次，加入ECL显色液显影，Bio－Rad蛋白分析仪扫描；此外，为进一步分析纯化抗原在血清学反应特异性，蛋白电泳和印迹转移后，与经TBST－5%脱脂奶粉稀的血浆（1∶1 000）室温孵育1h；加入 TBST－5%脱脂奶粉稀释的 HRP－抗人IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1h，加入ECL显色液显影，Bio－Rad蛋白分析仪扫描显色结果。

1．3．4 统计学分析 所有数据分析均采用Prism 5／Graphpad软件。ELISA结果分析时阳性Cut－off值取健康对照组均值加两个SD。两组数据比较均运用Mann Whitney检验，取P＜0．05时差异有统计学意义。

2 结果

2．1 结核分枝杆菌抗原HSP65和38kD的表达纯化 抗原HSP65和38kD经大肠杆菌原核表达纯化后，15%的SPS－PAGE胶电泳后以考马斯亮蓝染色检测表达抗原的纯度和分子量。HSP65分子量大小为56．7kD，38kD大小为38．2kD，结果显示（图1A）两个抗原均与预测蛋白分子量相同；同时两种纯化蛋白的纯度均达90%以上。经BCA法测定 HSP65、38kD浓度分别为0．26mg／ml、0．2mg／ml，用于下一步的血清学分析。Western Blot结果显示（图1B）两个抗原均为经 His－Tag标记的HSP65和38kD。

2．2 活动期结核病患者外周抗HSP65IgG和IgM水平分析 我们采用间接ELISA方法，以抗38kD的IgG为对照，分析了活动期结核病患者外周抗HSP65IgG的水平，结果显示患者外周针对两种抗原的IgG的水平均显著高于健康对照组（图2A）。对于HSP65，当我们以OD450nm＝0．5为反应阳性阈值时，所有活动期结核病患者以及6个健康人的IgG抗体均为阳性，其中56%的活动期结核病患者的IgG反应OD值大于2．0，表明抗 HSP65的IgG抗体在活动期结核病人的灵敏度相当高，当阈值为0．5时可达100%。对于38kD抗原，活动期结核病患者的IgG水平差异大，且IgG水平低反应（OD450nm＜0．5）的患者比例达26%。此外我们还检测了抗HSP65和38kD的IgG1和IgG2抗体水平，结果表明活动期结核病患者针对两种抗原的IgG1水平显著也高于健康对照组，而IgG2则未能检测到（数据未显示）。

图1 结核分枝杆菌抗原HSP65和38kD的表达和纯化

IgM是感染早期产生的抗体，对感染的早期诊断具有重要意义，因此我们在检测外周血浆抗HSP65IgG的同时，也检测了其特异性IgM的水平。结果显示（图2B）两种抗原抗IgM的水平均反应较低，并且患者外周血浆特异性IgM的水平低于健康对照组，其中抗HSP65IgM的水平降低具有显著差异；而抗38kD IgM的抗体水平在两组间没有显著性差异。

为了进一步验证上述ELISA分析中针对两种抗原的IgG反应的特异性，我们挑选了血清学反应为阳性的结核病人血浆和阴性的健康人血浆各一份进行蛋白印迹方法验证。结果显示（图2C），ELISA检测中反应阳性的病人血浆在蛋白印迹中能够特异性地与HSP65和38kD反应，而ELISA反应为阴性的健康人血浆则未能与两种抗原进行应答，由此表明我们所建立的ELISA分析方法的特异性和可靠性。

2．3 抗HSP65IgG抗体在结核病血清学诊断中的意义 ROC（Receiver Operating Characteristics）是分析生物标志物在疾病诊断中运用价值的重要方法；ROC曲线的 AUC（Area Under Curve）值越大，表明生物标志物的诊断意义越大。通过ROC分析活动期结核病患者和健康对照组IgG抗体反应的OD值（图4），我们发现HSP65和38kD的ROC曲线的AUC值分别为0．978和0．982。因此，与38 kD一样，抗HSP65IgG抗体对结核病的诊断具有良好的应用前景。

图2 活动期结核病患者外周抗HSP65IgG和IgM抗体水平及其特异性分析

另外，我们还分析了抗HSP65和38kD的IgG抗体在结核病诊断中的灵敏度和特异性（表2）。当阈值设为健康对照组的均值加两个SD时，抗HSP65IgG的灵敏度和特异性均为90%（OD阈值为1．04）；抗38kD IgG的灵敏度和特异性分别为88%和90%（OD阈值为0．33）；HSP65与38kD联合诊断的灵敏度升高至96%，特异性为80%。当阈值为0．5时，抗 HSP65的IgG抗体的灵敏度达100%，特异性为80%；而抗38kD IgG的特异性达100%，灵敏度为76%，HSP65与38kD联合诊断的灵敏度和特异性与HSP65单独诊断时一样，分别为100%和80%。因此，上述结果显示抗HSP65IgG在诊断中具有和38kD相当的灵敏度，在结核病的血清学诊断中具有潜在的应用价值。

图3 抗HSP65和抗38kD IgG抗体在结核病诊断中的ROC曲线分析

表2 抗HSP65和38kD IgG的检测灵敏度和特异性比较

2．4 抗HSP65IgG水平与结核病患者临床病理特征的相关性 通过收集结核病患者临床资料，我们比较分析了抗HSP65和抗38kD IgG抗体水平与患者临床病理特征的相关性，包括年龄、发病时间、治疗时间、抗酸染色、痰菌培养以及PPD反应性等。结果显示，抗HSP65和抗38kD IgG在空洞病变结核病患者中的平均水平均高于无空洞患者，其中抗HSP65IgG的水平差异具有显著性；而抗38kD IgG则没有统计学差异（图4）。由于患者出现空洞往往和疾病的严重程度相关，上述结果提示抗HSP65的IgG抗体水平与结核病的严重程度存在一定的正相关性。

图4 活动期结核病患者中空洞阳性患者与阴性患者之间抗HSP65IgG抗体水平的比较

2．5 抗HSP65IgG抗体在结核病血清学诊断中对抗38kD IgG的补充性 在上述结果基础上，我们进一步分析了抗HSP65IgG是否对现有结核诊断标志物具有补充作用，为此，通过综合分析同一患者中抗HSP65和38kD IgG水平，我们发现（图5），6个38kD IgG抗体阴性的结核病患者中，4个为抗HSP65IgG阳性；相反，5个抗HSP65IgG水平阴性的活性结核病患者中有3个是38kD IgG抗体阳性的，如表2结果所示，HSP65与38kD组合后（阈值为至少一个为阳性）能进一步提高检测灵敏度，本研究所测定的抗HSP65IgG可以作为目前商业化应用的针对38kD的抗体应答水平检测的补充，从而进一步提高诊断的灵敏度。

图5 抗HSP65与抗38kD IgG水平在结核病患者中的相关性

3 讨论

尽管近年来结核病的防控取得了一定的效果，但由于艾滋病的蔓延及耐多药结核病例的增长，在发展中国家，尤其是非洲和亚洲国家，结核病带来的公共卫生压力依然巨大［1］。因此我们仍需要在结核病的诊断、治疗和疫苗开发等方面做深入的研究。尤其在诊断方面，缩短时间和提高准确率（包括结核病的类型）能为结核病的早期治疗以及治疗方式提供依据，从而及时防止疾病的进一步扩散。相对于传统的结核病诊断技术，近年来出现的关于结核病诊断的新技术，比如基于PCR原理的Xpert－MTB／RIF能快速诊断耐多药结核病，但是该方法无法区分结核分枝杆菌的死活；基于特异性抗结核分枝杆菌细胞免疫应答的T－SPOT和Quanti－FERON方法（干扰素释放实验）是目前公认的较为准确和特异性的诊断手段，但是该方法价格高，操作具有一定的技术要求，同时不易区分结核分枝杆菌潜伏感染和活动性结核。所以，寻找更多的可用于临床诊断的新技术和新方法还是当前结核病研究中的重要内容。

血清学诊断具有简单、快速、高通量等优势，但其前提是要寻找获得特异性的血清生物标志物。血清学生物标志物根据其来源可以分为病原菌来源或是宿主来源，前者主要指来源于病原菌的抗原成分，如乙肝病毒感染后的HBsAg抗原；而宿主来源的血清生物标志物则是宿主在抗病原菌免疫应答中所产生的标志物。在结核病中，人体感染M．tb后，宿主免疫系统与M．tb的相互作用必然会产生特异的细胞免疫和体液免疫应答产物，如细胞因子、抗体等，其中有些分子就可能成为结核病的重要诊断指标，目前广泛应用的基于M．tb特异性抗原刺激引起的IFN－γ释放试验，如T－SPOT．TB等方法即是成功例子；但由于个体间差异以及M．tb病原菌的多样性等，这些试验在实际应用中存在灵敏度不够高、无法区分活动期与潜伏期感染等缺陷，因此寻找新的结核病免疫学标志物的研究仍然是全世界结核病研究人员关注的热点，一些新的免疫应答分子正在被关注，如Novel NC等研究发现人的全血在体外经M．tb抗原Rv0081刺激后产生的IL－12（p40），IL－10和TNF－a在活动期结核病的诊断中灵敏度和特异性均为100%［19］，Ji Young Hong等用 M．tb特异性抗原ESAT－6、CFP－10和 TB7．7刺激人的全血后检测上清中趋化因子IP－10的含量，发现IP－10能作为候选标志物用于活动期结核病的诊断，并且在活动期结核病患者血清中的IP－10含量比潜伏期感染者的高，因此血清IP－10能作为其他标志物的辅助用于结核病的诊断［20］；此外，血清IDO活性高低和肺结核的预后密切相关［23］；外周mi－29a也与活动期结核病相关［24］。

基于体液免疫应答的病原菌特异性抗原／抗体的血清学检测在临床疾病中得到广泛应用，目前常用的商业化的结核病血清学诊断试剂盒及所用抗原有Pathozyme TB complex plus（38kD和16kD），Pathozyme Myco （38kD、LAM），MycoDot（LAM），Anda－TB （A60），TB glycolipid Assay （6种M．tb细胞壁糖脂）等，这些试剂盒的平均灵敏度一般都在80%以下，但特异性基本都在90%以上［2］；同时还可以检测血清或其他体液（尿液、胸水等）中相关 M．tb抗原，如 LAM、ESAT－6、Ag85复合物等；其中对LAM的研究最为详细，HIV阳性的结核病患者尿液中LAM检出率为47%，但HIV阴性患者则只有14%［22］。虽然全球至少有73家生产商生产和销售不同的结核病血清学诊断试剂盒，但这些试剂盒中的诊断效果还有待于进一步提高［21］。

本研究发现的抗HSP65IgG有可能成为新的活动期结核病血清学候选标志物。HSP65属于HSP60家族，该家族在原核和真核生物中高度保守，能辅助正常或者应激条件下机体内蛋白质分子的正确折叠［9］。在原核生物中，HSP60又称为GRoEL，一般细菌基因组只含有一个GRoEL基因，而分枝杆菌属含有GRoEL1和GRoEL2两个基因，后者即为HSP65［10］。在应激条件下，结核分枝杆菌可大量表达保守性抗原，并分布于胞内、荚膜，以及分泌至胞外。在机体抗M．tb免疫中，HSP65扮演着重要角色：分布在 M．tb荚膜层的HSP65分子能促进M．tb与巨噬细胞的相互作用［11］；促进树突状细胞对病原菌抗原的交叉递呈［12］。HSP65还能诱导很强的T细胞和B细胞应答，M．tb免疫过的小鼠体内存在的M．tb特异性T细胞中20%是HSP65特异性的［13］；而40%的麻风病人体内存在大量的抗HSP65抗体［14］。有报道在结核病患者的胸水［6］和结核性脑膜炎患者的脑脊液中［7］都检测到了抗原HSP65。但至今还没有研究报道过抗HSP65的抗体在结核病血清学诊断中的作用。我们研究结果发现90%的活动期结核病患者血浆中都能检测到抗HSP65IgG抗体，而且空洞阳性患者的抗HSP65IgG抗体明显高于空洞阴性患者，提示该抗体与患者体内的细菌载量或病情的严重程度呈正相关。

血清学诊断在细菌性感染疾病中应用则受到很大的限制，这可能是因为和病毒来源的抗原种族特异性相比，细菌性抗原与其他细菌甚至宿主蛋白存在结构同源性。本研究中的分枝杆菌抗原HSP65与人HSP60蛋白的氨基酸序列存在47%同源性，因此人体感染M．tb后可能会引起针对自身抗原HSP60的免疫反应。HSP65反应性T细胞与自身抗原HSP60的交叉反应可能是类风湿性关节炎的发病机制之一［15－17］。但竞争ELISA试验表明人血清中的抗HSP65的IgG抗体不与HSP60交叉反应，反过来抗HSP60的IgG抗体也不与HSP65反应［18］。因此，HSP65可以作为候选抗原用于结核病的血清学诊断应用。

综上所述，本研究通过间接ELISA方法比较分析活动期结核病人外周抗HSP65IgG和IgM的水平，结果显示HSP65作为一种重要的结核分枝杆菌病原菌抗原，其所诱导的体液免疫应答在结核病血清学诊断中具有应用潜力，上述研究也为开发新的多抗原联合的血清学诊断试剂盒提供了新的候选靶抗原。

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