壳聚糖纳米粒子基因载体的制备与相关研究

李世龙，邵国喜，刘钦毅＊，周 贺

（1．长春师范学院，吉林 长春130032；2．吉林大学第二医院，吉林 长春130041；3．65316部队医院）

随着对脊髓损伤发病机制的不断深入研究，分子生物学技术的不断进展和人类基因组计划的划时代完成，脊髓损伤的医学研究已经进入基因治疗的时代。许多研究表明，GDNF对脊髓神经元具有很强的营养活性，并能促进轴突生长，如果能够使GDNF基因在损伤的脊髓中高效表达，则能有效地减轻脊髓继发性损伤，促进脊髓功能恢复。

在纳米颗粒的表面通过静电作用，吸附DNA，或通过化学键耦联DNA，可作为基因的载体，为基因治疗中的DNA传递带来了新的希望。

1 材料与方法

1．1 实验材料

实验材料LB培养基，RNase，壳聚糖，脱乙酰度90%等，实验所用PcDNA3．1／GDNF已经合成［1］。实验仪器有电磁力搅拌器，Zetasizer HS3000检测仪，QL－901旋涡混合器，Finnpipette转移器，紫外分光光度仪，电泳槽，凝胶成像系统等。

1．2 质粒壳聚糖纳米粒子的制备

首先用复凝聚法制备壳聚糖纳米粒子，称取壳聚糖500mg，将之溶解于1%乙酸溶液中，浓度为0．5%（pH 为5．5），充分搅拌，至澄清为止，经0．22 μm的微孔滤膜过滤除菌。将质粒基因进行大量扩增。将100μl质粒基因溶液（120μg／ml）和10 mMNa2SO4100μl混合于一EP管中，壳聚糖溶液200μl放于另一EP管中，55℃水浴中加热20min，将质粒混合溶液快速移入壳聚糖溶液中，在旋涡混合器上震荡1小时 。以12 000r／min，离心30分钟，沉淀以 PBS（pH 为5．5）重悬，即为 CS／pcDNA3．1／GDNF混悬液。

1．3 实验检测

1．3．1 壳聚糖纳米粒子的物理性能检测

（1）取少量纳米粒混悬液滴至铺有碳膜的铜网上，静置5min，用滤纸吸干混悬液的液滴，于电子显微镜下观察纳米粒形态。

（2）取少量纳米粒混悬液应用微粒度仪检测其粒径大小。

（3）将纳米粒混悬液的pH分别调整为3、5、7、9时，应用Zetasizer HS3000检测仪检测纳米粒子表面的电位。

（4）取壳聚糖纳米粒子质粒基因复合体样品适量，放入带瓶塞的锥形瓶中，分别于25℃和37℃条件下放置，10d后观察其物理外观、测定其平均粒径，考察壳聚糖纳米粒子质粒基因复合体的稳定性。

1．3．2 壳聚糖纳米粒子与质粒基因结合效率的检测

（1）分别取3份50μl壳聚糖纳米粒子分别调至pH为3、5、7、9和3份50μl的质粒基因溶液加入不同的Eppendorf管中，于55℃温浴20分钟。

（2）将50μl纳米粒与相同体积的质粒均匀漩涡振荡1分钟。

（3）1% 琼脂糖凝胶 60V 电泳30min，pcDNA3．1／GDNF经溴乙腚染色显示。

（4）紫外透射仪观察并凝胶照相。

1．3．3 壳聚糖纳米粒子对质粒基因保护效果的检测

为了检测壳聚糖纳米粒子对质粒基因保护效果，在制备纳米粒子后将纳米粒子与质粒基因结合，然后用DNase I消化，再通过凝胶电泳观察保护效果。取100μl壳聚糖纳米粒子与100μl的质粒基因溶液预热后混合（同上），后加入Eppendorf管中，并向管中加入1．0μl DNase I，37℃水浴1小时后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外透射仪观察并凝胶照相。

1．3．4 壳聚糖纳米粒子质粒基因复合体体外释放质粒基因的实验

将制备壳聚糖纳米粒子质粒基因微粒沉淀（20 mg）以1ml PBS（pH7．4）重悬，于37℃水浴恒温振荡器中轻摇，每一小时离心，取10μl上清液后，再次重悬。UV法在波长260nm处测定上清液中质粒基因的浓度，制作标准曲线，观察壳聚糖纳米粒子质粒基因复合体体外释放质粒基因的特点。

1．3．5 载基因纳米粒的载药量和包封率的测定

在纳米粒制备过程中包封率和载药量是两个比较重要的指标。载药量能够反映壳聚糖加载基因的能力；包封率可以反映纳米粒制备方法的优劣。在测定包封率和载药量时，我们采取的策略是首先测试出在纳米粒制备过程中未被包封的GDNF质粒和未成粒子的壳聚糖的含量，然后再根据制备纳米粒时GDNF质粒和壳聚糖的投料量分别计算出包封率和载药量。

1．4 统计方法

计量资料采用¯x±s，用SPSS12．0对数据进行统计学处理。

2 实验结果

2．1 壳聚糖纳米粒子的物理性能

2．1．1 扫描电镜的检测结果显示壳聚糖纳米粒子为白色，圆形或略呈椭圆形，在混悬液中分布均匀，经高速离心浓缩后单位视野分布较均匀。壳聚糖纳米粒径大小分布成正态分布，平均粒径大小为106 nm，最大粒径为228nm，最小粒径为52nm。

2．1．2 当纳米粒子混悬液的pH分别调整为3、5、7、9时，壳聚糖纳米粒子的Zeta电位发生了变化，当混悬液处于pH＝3的酸性环境下，其Zeta电位为＋16．3±0．4mv，说明纳米表面带有较多正电荷，当混悬液pH＝5的环境下，Zeta电位为＋3．5±0．2，说明纳米粒表面仍然带有部分正电荷，当混悬液pH＝7或pH＝9时，纳米粒表面Zeta电位分别为－11．5±0．3与－19．1±0．5，说明纳米粒子表面带有负电荷。可见，pH对壳聚糖纳米粒的Zeta电位的影响较大。

2．1．3 壳聚糖纳米粒子质粒基因复合体稳定性观察，见表1。纳米粒在4℃、20℃、37℃时放置5d、10 d。观察其形状无明显变化，均为圆形、平均粒径在4℃时无明显变化，在20℃、37℃时粒径略缩小，说明其性质较稳定，可满足后续实验研究的需要。

表1 壳聚糖纳米粒子质粒基因复合体稳定性观察

2．2 结合效率检测

1%琼脂糖凝胶电泳显示，壳聚糖纳米粒子能有效结合质粒，紫外透射仪观察和凝胶照相显示的是在不同酸碱度条件下壳聚糖纳米粒和质粒的结合情况。在酸性条件下（pH＝3与pH＝5时），质粒结合能力较强，电泳中显示泳动速度慢，几乎未出孔，pH＝7，pH＝9时，壳聚糖纳米粒和质粒结合能力弱，电泳显示泳动速度较快。

2．3 基因保护试验

与壳聚糖纳米粒结合的pcDNA3．1／GDNF质粒加入0．5UDnase I，37℃水浴1h后紫外透射仪观察和凝胶照相均显示明显的DNA条带，而未与壳聚糖纳米粒结合的pcDNA3．1／GDNF质粒则无明显的DNA条带，结果显示壳聚糖纳米粒子有良好的DNA保护作用，使不被DNase I降解。

2．4 壳聚糖纳米粒子基因释放实验

纳米粒的质粒释放曲线如图1，可以看出纳米粒中质粒释放明显呈两相释放模式。第一阶段在释放初期，质粒出现迅速释放，在20h内释放了将近60%，这是微球表面和浅层结构内释放出来。之后的第二阶段，质粒是随着壳聚糖在缓冲溶液中的溶解而释放，释放速度趋于平缓，到48h时仅释放了不到20%，然后质粒继续缓慢释放。

图1 纳米粒子释放质粒实验

2．5 载药量和包封率的测定结果

见表2和表3，从测定结果看，纳米粒的载药量和包封率都比较理想。

表2 包封率的测定结果

表3 载药量的测定结果

3 讨论

近年来，随着分子生物学的飞速发展，脊髓损伤治疗取得了很大的进展，其中细胞移植和基因治疗给脊髓损伤带来了新的希望，它们可以改善损伤局部的微环境，可以保护脊髓神经元，减少细胞凋亡，促进轴突的再生，最大限度的促进脊髓损伤恢复。

在基因治疗中，营养与保护的基因主要包括神经营养因子基因族，包括神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子，脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子等。受体细胞有雪旺氏细胞、嗅鞘细胞、神经分泌细胞和成纤维细胞等，其中雪旺氏细胞应用很广。Lee［1］等应用逆转录病毒将Bcl－X（L）基因转入神经干细胞中观察Bcl－X（L）过度表达后对细胞的凋亡的影响，结果表明在2－7周细胞期间内细胞内高效表达Bcl－X（L），并在这个时间间期内完全阻止了细胞凋亡。Tuszynski等［2］将NGF基因转染培养的雪旺细胞后，移植到SCI部位，发现雪旺细胞在体内稳定地表达NGF，并促轴索再生。Barakat等［3］将携带GDNF的重组腺病毒转入脊髓横断损伤的新生鼠后肢骨骼肌中，结果在腰段脊髓的运动神经元中发现携带胶质源性的神经元营养因子表达，并保护了运动神经元免于轴突断裂诱发的细胞死亡；不管在体外和体内的测试，GDNF都能提高胚胎运动神经元的存活及分化，减少运动神经元的凋亡，具有明显的营养作用［4］。

研究表明，利用纳米技术，如利用金纳米微粒结合杂交DNA片段，很容易进入机体细胞核并与核内染色体组合，具有较高的特异性［5］，壳聚糖是一种具有生物相容性和可生物降解的新型医用生物材料，具有无刺激、无致敏、无抗原性、无致突变等优点，壳聚糖及其衍生物能与DNA形成聚电解质聚合物，是具有持久安全性和高效的阳离子聚合物基因转移运输载体，其应用前景较好［6］。在溶液中CS分子带有大量正电荷，能与质粒DNA形成50－200 nm粒径复合物，使DNA分子免受破坏。与聚乙二醇（PEG）等非生物降解的材料相比，此复合物是非常有效的体外或体内基因转运系统。

在我们的实验中，应用复凝聚法制备CS／pcDNA3．1／GDNF，在电镜下观察 CS／pcDNA3．1／GDNF的形状、大小、表面Zeta电位，并检测CS－nano／pcDNA3．1／GDNF的稳定性，观察壳聚糖纳米粒子与pcDNA3．1／GDNF的结合效率和对pcDNA3．1／GDNF的保护能力，壳聚糖纳米粒子的缓释试验，并检测壳聚糖纳米粒子的基因负载力和负载率。结果表明，应用复凝聚法成功制备壳聚糖纳米粒子，粒子大小符合基因转染的需要，粒子性能稳定；壳聚糖纳米粒子与基因结合效率较高，对基因有很好的保护作用；壳聚糖纳米粒子具有缓释效果，其基因负载力和负载效率均较高。因此，壳聚糖纳米粒子可以作为基因载体进行脊髓损伤基因治疗的实验研究。

［1］Lee SI，Kim BG，Hwang DH，et al．Overexpression of Bcl－XL in human neural stem cells promotes graft survival and functional recovery following transplantation in spinal cord injury［J］．J Neurosci Res，2009，87（14）：3186．

［2］Tuszynski MH，Weidner N，McCormack M．Grafts of genetically modified Schwann cells to the spinal cord：survival，axon growth，and myelination［J］．J Cell Transplantation，1998，7（2）：187．

［3］Barakat DJ，Gaglani SM，Neranetla SR，et al．Survival，integration，and xon growth support of glia transplanted into the chronically contused spinal cord［J］．Cell Transplant，2005，14（4）：225．

［4］Zhou LH，Wu W．Survival of injured spinal motoneurons in adult rat upon treatment with glial cell line－derived neurotrophic factor at 2weeks but not at 4weeks after root avulsion［J］．J Neurotrauma，2006，23（6）：920．

［5］Halberstadt C，Emerich DF，Gonsalves K．Combining cell therapy and nanotechnology［J］．Expert Opin Biol Ther，2006，6（10）：971．

［6］Zhang HL，Zhu DW，Yang J，et al．Cellular uptake and cytotoxicity of modified chitosans as gene carriers［J］．Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2006，28（4）：486．