慢性乙型肝炎患者干扰素-α治疗应答与干扰素-α/β受体启动子-408基因多态性的相关性*

李发武 丁慧俊 王文琦 吴福全 殷思纯 李婉霞 何松美 王艳娜

东莞市人民医院感染内科(广东东莞，523059)

乙肝病毒 (HBV)感染的发病机制复杂，HBV基因组研究结果不能完全解释HBV感染广泛的疾病谱。即使相同的病毒分离株在感染不同宿主时，临床表现和转归都有很大差异。HBV感染后的不同临床结局与宿主相关基因的多态性有关［1～3］。我们的前期研究证实，IFN-α/β受体基因启动子-408位点存在SNP，并与HBV感染不同临床转归有关［4］。本研究试图探索IFN-α/β受体基因多态性与IFN疗效之间的关系，以期为制定治疗方案和疗效预测提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 210例CHB患者均为2009年12月至2012年3月在东莞市人民医院住院或门诊就诊患者。入选标准按2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会西安会议联合修订的《病毒性肝炎防治方案》CHB诊断标准［5］。年龄18～76岁，汉族。轻度38例、中度102例、重度70例即按轻、中、重度分为3组，所有研究对象均无亲缘关系，无原发性心、肺、肾及高血压等病史，排除其他慢性肝病的致病因素存在，如非HBV感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝等。对其中既往未用过IFN治疗的80例CHB患者按适应症给予Peg-IFN-α-2a/2b治疗。

1.2 治疗方案 Peg-IFN-α-2a，180μg/次，每周1次，皮下注射，疗程48周;或Peg-IFN-α-2b，1.0～1.5μg/kg体重，每周1次，皮下注射，疗程48周。具体剂量可根据患者的耐受性等因素进行调整。在治疗前、治疗期间及随后均未使用其他抗病毒和免疫调节药物。在治疗0、12、24、36、48周及停药24周时随访，并检测其肝功能、HBV-M、HBV DNA、AFP、血常规、凝血酶原时间、甲状腺功能及血糖等。

1.3 疗效评价 SR［6］:疗程结束及停药24周时ALT正常，HBeAg阴性，HBeAb阳性，PCR检测HBV DNA＜500 copies/ml。NSR:未达上述标准的任意一种情况。

1.4 引物设计与合成 从GenBank下载人IFN-α/β受体A亚单位基因全部序列登录号:X60459(gi:32671)，应用 PRIMER5.0，设计引物:IFNAR1F(rs20358504-rs20358521 ): TCCAAGGGACCATCTCGC，IFNAR1R (rs20359218-rs20359199):GCAGATCCCACCAGTTACAT，基因片段间含-408位点，由广州市金域生物技术有限公司合成，PCR及基因测序。

1.5 人类基因组DNA提取 取EDTA抗凝静脉血2 ml，分装，－20℃冻存，采用 Roche提供 ActiTaq DNA polymerase基因组提取试剂盒提取基因组DNA，－20℃分装冻存。

1.6 PCR条件 PCR扩增反应体系均为20μl，10×PCR Bufer(含 镁 离 子)1.5μl，25mmol/L dNTP 0.5μl，目 的 引 物 各 10μmol/L 0.1μl，内 参 引 物10μmol/L 0.16μ1，DNA 提 取 物 100ng/μl 0.5μl，TaqDNA 聚合酶 1U/μl 0.2μl，加去离子水至 15μl。把PCR反应管置PCR仪中，94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即先94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，重复35个循环后，于72℃再延伸7分钟。

1.7 扩增产物基因型分析 直接测序，用Chromas软件分析测序结果，与参考序列X60459进行比对。

1.8 统计学方法 全部数据输入计算机，用SPSS 16.0软件分析，等位基因和基因频率采用直接计数法，组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。统计学显著性检验为双侧，检验的显著性界限水平为0.05。

2 结果

2.1 IFN-α/β-408位点SNP分布 基因型频率分析符合 Hardy-Weinberg定律。IFN-α/β-408位点存在CC、CT、TT 3个基因型，C、T两个等位基因，分布频率见表1。210例CHB患者IFN-α/β-408位点基因型频率为CC纯合型111例 (52.9%)，CT杂合型69例 (32.9%)，TT纯合型30例 (14.3%)。等位基因C频率 291(69.3%)，T频率 129(30.7%)。CHB患者轻、中、重度各组间基因型分布频率比较(χ2=1.991，P=0.737)及等位基因分布频率比较(χ2=1.888，P=0.389)差异均无显著性意义。

表1 IFNα/-β-408位点多态性的基因型及等位基因频率分布

2.2 IFN-α/β-408位点基因型、等位基因频率与IFN应答的关系 见表2。80例CHB患者经Peg-IFN-α-2a/2b治疗的应答情况为 SR组 33例(41.3%)，NSR组47例 (58.7%)，在两组患者中，均检出 IFN-α/β-408位点 CC、TT、CT基因型。CT基因型患者IFN治疗持久应答率为65%(13/20)，显著高于CC基因型患者的29.5%(13/44)，两者相比差异有显著性意义 (χ2=7.166，P=0.007)。χ2检验和Fisher确切概率法检验结果表明，IFN治疗SR组IFN-α/β-408位点等位基因C、T的频率与NSR组的频率比较，差异无显著性意义 (P＞0.05)。

表2 IFNα/-β-408位点多态性的基因型及等位基因与IFN应答的关系

3 讨论

Peg-IFN-α是CHB的主要治疗药物之一，其诱导机体产生抗病毒效应需要两个重要的条件:一是与细胞膜上特异性受体结合，二是与受体结合后发生细胞内信号转导，通过激活下游的JAK-STAT等信号途径，导致一系列IFN诱导的抗病毒蛋白基因的表达，产生多种抗病毒蛋白，从而达到抗病毒作用。

临床上，应用IFN治疗的人群往往应答效果差异很大。研究发现，除了病毒变异、肝炎活动度或ALT值、性别、年龄及宿主的免疫状态等影响IFN-α疗效外，宿主IFN遗传通道上众多基因的SNP也是影响IFN 应答的重要因素［7，8］。

外源性和内源性IFN-α均需要与靶细胞上特异性IFN-α/β受体结合，才能产生抗病毒作用和调节机体免疫功能。IFN-α/β受体基因具有多态性，基因型不同导致IFN-α/β受体表达差异，从而影响HBV感染后临床结局，并可能对IFN-α抗病毒效应产生影响。樊和斌等［9］发现，IFN受体表达水平在不同临床型慢性肝病患者中有显著差异。何生松等［10］发现IFN治疗CHB患者其疗效与细胞膜上IFN-α/β受体表达水平密切相关。Lee CM等［11］发现慢性丙型肝炎患者肝组织内IFN受体的表达量 (mRNA)与IFN的持续应答率有关。我们前期的研究发现［4］，IFN-α/β受体基因-568位点和-408位点的多态性与HBV感染不同的临床结局具有明显的相关性，携带-408CC基因型的患者容易进展为CHB甚至肝硬化。提示-408CC基因型是慢性活动性肝病的易感基因型。

有关IFN-α/β受体基因多态性对 IFN-α疗效影响的临床研究尚未见报道。为此，我们探索了IFN-α/β受体基因-408位点多态性与IFN疗效的相关性。结果显示，210例CHB患者IFN-α/β-408位点基因型频率为CC纯合型111例 (52.9%)，TT纯合型30例 (14.3%)，CT杂合型69例 (32.9%)，408位点CC基因型与CHB高危可能相关。

Peg-IFN-α-2a 与 Peg-IFN-α-2b 已批准用于治疗CHB。两者可取得类似的HBV DNA抑制率、HBeAg血清学转换率和 HBsAg清除率［6，11］。本研究中，80例符合适应症的患者，其治疗结果提示IFN-α/β受体启动子-408为CT杂合基因型的CHB患者可能对Peg-IFN治疗效果较好。尽管如此，IFN-α/β受体启动子-408位点多态性与IFN-α/β受体 mRNA及受体蛋白表达水平的关系有待进一步阐明。

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