蒲公英抗氧化活性部位研究1）

戎晋华，赵文英＊，黄巧燕，李学强

（1.青岛科技大学化工学院，山东 青岛266042；2.青岛市海泊河污水处理厂）

蒲公英为菊科蒲公英属植物，是临床上常用的中药材，具有很多的药理作用，主要包括抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用，是有非常好的开发前景的可以药食同用的中草药。蒲公英含有多种有效成分，如黄酮类、倍半萜内酯类、酚酸类、蒲公英甾醇、挥发油类等［1］，这些成分大多具有较强的抗氧化活性。目前人们对其各类成分的提取研究报道较多，因其有“天然抗生素”之美称，对其活性研究主要集中在抑菌活性方面，而对其他作用报道较少，尤其是抗氧化活性的研究目前尚少见报道。大量研究证实，中草药能延缓衰老与治疗疾病大多与其抗氧化作用密切相关。本试验采用传统水提法来提取蒲公英，然后将提取液用不同极性的有机溶剂分层萃取，并研究各层提取物的抗氧化活性，为进一步研究蒲公英中抗氧化活性成分提供依据，为蒲公英的开发应用积累有价值的资料。

FRAP法［2］、超氧阴离子清除率法和DPPH法这三种方法广泛应用于各种天然提取物抗氧化活性的测定，是较简便快捷的测抗氧化能力的方法。FRAP法测定总抗氧化能力，测量的是酸性条件下抗氧化物将Fe3＋还原成Fe2＋的能力。超氧阴离子清除率法是根据抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除能力对其抗氧化性能进行评价。DPPH法是根据抗氧化剂清除DPPH·自由基的能力测得抗氧化剂的活性。DPPH·不能与只含有一个－OH的芳香酸反应，也不能与B－环上没有－OH的类黄酮反应。利用这三种方法全面衡量蒲公英的抗氧化活性，为蒲公英的抗氧化活性研究及天然药物的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

M297714型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；DZKW－4型电子恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；KH－250DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪有限公司；RE－52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；GZX－9070MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LG－04A型四两装高速中药粉碎机，瑞安市百信药机器械厂；UV762型紫外／可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

蒲公英，购于本地德全堂大药店；三氯化铝标准品，山东威世达实业有限公司；DPPH标准品，美国sigma公司；TPTZ标准品，美国sigma公司；FRAP工作液（由25mL 300mmol／L pH3.6的醋酸盐缓冲液、2.5mL 10mmol／L TPTZ 溶 液、2.5mL 20mmol／L FeCl3溶液混合而成）。其它试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 传统水提法

称取50g蒲公英药材，加入约500mL蒸馏水（料液比为1∶10），加热至煮沸提取30min，提取3次，合并三次提取液，浓缩至约800mL。用75%乙醇多次醇沉多糖，取上清液。

将提取液用多层纱布过滤3次，收集澄清的黄色滤液约300mL，置于500mL的分液漏斗中，加入100mL石油醚进行溶剂萃取，收集上层溶液，同法萃取三次，合并上层石油醚萃取液。再用相同方法依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，收集下层水层。

分别将各层提取液置于旋转蒸发仪中旋转蒸发，收集各层提取物，水浴锅上干燥，称量，保存。

1.2.2 蒲公英的抗氧化活性实验

1.2.2.1 FRAP法总抗氧化力测定

标准曲线的绘制：分别吸取不同浓度的FeSO4标准液0.1mL，加入3.0mL FRAP工作液，再加入0.3mL去离子水，混匀，准确反应5min，于593 nm处测定其吸光度，用去离子水调零，作标准曲线，得回归方程：y＝0.1761x－0.0757，R2＝0.9995，在0.15～0.90mmol／L范围内线性关系良好。样品的抗氧化能力以FRAP值表示［3］：1FRAP单位＝1mmol／L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的mmol／L数。

称取各层提取物适量，配制成一定浓度的溶液，分别量取0.1mL溶液，加入3.0mL FRAP工作液，再加入0.3mL去离子水，混匀，准确反应5 min，于593nm处测定其吸光度，用去离子水调零。

1.2.2.2 超氧阴离子清除作用［4］

称取各层提取物适量，配制成一定浓度的溶液，取0.05mol／L，pH为8.2的Tris·HCl缓冲液4.5 mL于试管中，置于25℃水浴中预热20min，加入不同溶剂提取的蒲公英提取液0.1mL，2.5mol／L邻苯三酚0.4mL，混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用10mol／L HCl两滴终止反应，并在299nm处测定吸光度（用蒸馏水调零），空白组的0.1mL去离子水代替样品，并按下式计算清除率：

清除率＝（1－A试样／A空白）×100%；

1.2.2.3 DPPH·自由基清除能力［5］

配制5×10－5mol／L的DPPH·溶液。分别取各层提取物0.01g与50mL甲醇配成0.2g／mL的溶液。取各溶液1.5mL与甲醇2.5mL配成溶液，再取各溶液1.5mL与DPPH溶液2.5mL配成溶液，最后取DPPH溶液2.5mL与甲醇1.5mL配成溶液，充分震荡后黑暗下室温放置，30min后测定混合溶液在517nm处的吸光度。利用DPPH溶液的特征紫红色基团的吸收，用紫外－可见分光光度法测定反应后的提取物溶液在517nm吸收的下降程度表示其对有机自由基的清除能力。

试样提取液对DPPH·自由基的清除率可用下式计算：

P＝［1－（Ai－Aj）／Ac］×100%

其中，Ai＝2.5mL DPPH溶液＋1.5mL待测溶液吸光度；Aj＝1.5mL待测溶液＋2.5mL溶剂的吸光度；Ac＝2.5 mL DPPH＋1.5mL溶剂的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 蒲公英的提取

由上表得，各层提取物的质量分布趋势：水层＞正丁醇层＞乙酸乙酯层＞石油醚层。提取液中水层质量最多，且远远大于其他三层，而其他三层质量相差较少。水层为极性成分，正丁醇层和乙酸乙酯层为中极性成分，石油醚层为非极性成分，说明蒲公英中成分质量分布为强极性成分＞中极性成分＞非极性成分，极性成分相对较多。

2.2 蒲公英的抗氧化活性

图2 各层提取物对超氧阴离子清除率

图3 各层提取物对DPPH·自由基的清除率

由以上数据得，3种方法所得结果基本一致，各层提取物均具有超氧阴离子和DPPH·自由基清除作用，均具有抗氧化活性，蒲公英中含有很多抗氧化成分，黄酮类物质是主要的天然抗氧化剂［6］，它具有活泼的酚羟基，在遇到活性氧自由基时，易失去酚羟基上的氢，具有直接清除或淬灭·、·OH、H2O2等活性氧、自由基的作用［7］。蒲公英提取物包括黄酮和其它含酚羟基的化合物，在这个过程中可能起着互补或者协同的作用。

三种方法各层提取物的抗氧化能力均为：正丁醇层＞乙酸乙酯层＞水层＞石油醚层。石油醚萃取的是非极性成分，如脂质、挥发油、游离甾体及三萜类化合物等，乙酸乙酯主要萃取出游离生物碱、有机酸、黄酮、香豆素苷元等中等极性的物质，在乙酸乙酯后用正丁醇萃取，正丁醇相中一般来说是中等极性中极性相对较大的成分，含苷类成分比较多。也就是说，乙酸乙酯层中可能主要含有黄酮类、香豆素类和酚酸类等抗氧化活性较强的成分，正丁醇中可能含有黄酮苷等抗氧化活性较强的成分，水层含有的蛋白质和多糖也有一定的抗氧化活性，石油醚中含有的倍半萜内酯类及植物甾醇等也有抗氧化活性。

但3种方法所得结果也有所差异，FRAP法中水层和石油醚层抗氧化活性相当，超氧阴离子清除率法中水层和乙酸乙酯层抗氧化活性接近，DPPH法中正丁醇层和乙酸乙酯层抗氧化活性基本相同，其他则相差较多；而超氧阴离子清除率法和DPPH法都用清除率表示，但二者所得的清除率相差很多，这说明这3种方法是从不同层面对抗氧化活性进行评价，能全面反应蒲公英的抗氧化活性。

提取物虽然水层质量较多，但抗氧化活性较弱，因此水层通常视为杂质，不予研究。而活性最强的是正丁醇层和乙酸乙酯层，说明蒲公英中具有抗氧化活性的成分大多数是中极性的，且是极性中极性偏大的，少数是极性的和非极性的。这可能是由于蒲公英中主要的抗氧化活性成分［8］既有以苷元形式存在，又有以苷的形式存在的，分别被乙酸乙酯和正丁醇萃取。具体这两层中含有哪些成分，还需进一步研究。

3 结论

文中采用FRAP法抗氧化活性实验、超氧阴离子清除率抗氧化活性实验和DPPH·自由基清除能力抗氧化活性实验这3种方法来检测蒲公英各层提取物的抗氧化活性，结果可以看出，3种方法得各层提取物的抗氧化活性都是正丁醇层＞乙酸乙酯层＞水层＞石油醚层。

实验将蒲公英提取液用极性不同的3种有机溶剂分别萃取，即将提取液中各成分按极性不同分开，然后研究各部分的抗氧化活性，从而找到抗氧化活性最强的成分，为蒲公英有效成分的纯化分离提供依据，有助于进一步研究蒲公英的成分，可以更好地促进蒲公英的抗氧化活性在医药及保健等领域的开发、应用。蒲公英作为一种资源广、提取方便、抗氧化作用显著的药用资源，用来研究开发具有抗氧化功能的化妆品、保健品和药物具有广阔的应用前景。

［1］ 金善花，全光石.中药材抗氧化剂的研究概况和发展趋势［J］.中国中医药现代远程教育，2011，9（12）：157－160.

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