白头翁皂苷酶解产物促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成

安 家 彦, 王 东 明, 刘 春 莹, 曹 体 爽, 王 伟, 正 木 仁, 鱼 红 闪, 金 凤 燮

( 1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034; 2.日本日光化学(株)化妆品技术研究中心, 东京都 )

0 引 言

白头翁为毛茛科植物白头翁Pulsatillachinensis(Bge.) Regel的干燥根,为常用中药,具有清热解毒、凉血止痢功效。白头翁皂苷是重要的活性成分之一,质量分数占白头翁的8%～10%,皂苷中80%以上是5个糖基的皂苷[1],其中以白头翁皂苷B4的含量最高,药典规定其质量分数不低于4.6%[2-3]。现代药理学研究表明,白头翁皂苷具有抗肿瘤、抗菌、抗血管舒张等作用[4-5]。天然存在的白头翁皂苷大多含有5个糖基,难以被人体吸收利用,并具有一定的溶血性[1],而低糖基的皂苷则易于被人体吸收。皮肤纤维芽细胞中胶原蛋白含量的高低,对肌肤的光泽、弹性、老化具有重要影响。年轻人的真皮中,胶原蛋白含量很高,一般在90%以上。随着年龄的增长,其含量逐渐降低；另外,在外界环境中,例如紫外线等对皮肤内胶原蛋白的合成也有阻碍作用[6]。维生素A或维生素A酸衍生物作为添加剂添加在化妆品中[7],具有一定的促进胶原蛋白合成的作用,但对皮肤有一定的副作用；另外一些效果较好的抗皮肤老化添加剂,虽然副作用低,但是因为价格昂贵而难以普及。因此,找到一种能促进皮肤中胶原蛋白的合成、抗老化效果较好而价格较低的添加剂,对化妆品行业具有重要意义[8]。

本实验室前期从微生物中筛选出白头翁皂苷酶,在体外对多糖基的白头翁皂苷进行水解,制备了低糖基的白头翁皂苷酶解产物[9-10],其中主要成分是白头翁皂苷元、1糖基白头翁皂苷和2糖基白头翁皂苷,其结构如图1所示。为了得到廉价的皮肤抗老化化妆品的添加剂,作者研究了白头翁皂苷的酶解产物对皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成的影响。

Glc,葡萄糖基；Ara,阿拉伯糖基

1 实 验

1.1 材料和仪器

白头翁皂苷酶解产物,本实验室提供；测定胶原蛋白的苏米龙H 型多孔试剂盒,日本住友公司；皮肤纤维芽细胞I型,日本日光化学有限公司。

1.2 方 法

为了检测白头翁皂苷酶解产物对纤维芽细胞胶原蛋白合成的影响,用苏米龙H型多孔试剂盒进行免疫抗体法(ELISA)检测。

以含有5%小牛血清(FBS)的DMEM作为培养基,首先将纤维芽细胞接种于此培养基上,分放于96孔板中。在培养24 h以后,换成含有低糖基白头翁皂苷样品的5% FBS的DMEM溶液,再培养48 h后测定细胞中胶原蛋白与总蛋白的质量。

总蛋白量的检测:先用0.1%的Triton X-100溶液将细胞破碎溶解,然后采用Lowry法[11]测定蛋白含量。胶原蛋白的质量用ELISA抗体法测定,并绘制胶原蛋白的标准曲线。将上清液与苏米龙H型多孔试剂盒试剂混合,于4 ℃过夜,然后加入1%的小牛血清蛋白(BSA)溶液,37 ℃下保持1 h,再加入0.3%的BSA溶液、稀释100倍的PO(兔)抗体,在37 ℃反应1 h,最后用0.3 mg/mL 的2,2-偶氮(3-乙基联苯胺-6-磺酸)二胺盐[2,2-Azinobis-(3-ethylbenzoline-6-sulfonic acid) diammouium salt (ABTS)](溶解于0.1 mol/L pH 4.0的磷酸-柠檬酸缓冲液)反应20 min,测定波长405 nm的吸光值。

培养基中的ELISA所测定胶原蛋白的质量,通过与相同96孔板所测得的标准曲线作对照查得。胶原蛋白合成量计算公式:

胶原蛋白合成量(ng/mg)=ELISA所测定胶原蛋白量(ng/孔)÷Lowry法测得的总蛋白量(mg/孔)。

胶原蛋白合成能力的测定:将没有添加样品进行培养的细胞合成胶原蛋白的能力作为100%,含有不同浓度低糖基白头翁皂苷样品培养的细胞胶原蛋白合成量以“%”来表示。胶原蛋白合成情况的实验结果用Student T法进行误差处理并评估效果。

2 结果与讨论

2.1 白头翁皂苷酶解产物对胶原蛋白合成的影响

从表1可以看出,添加白头翁皂苷酶解产物(低糖基白头翁皂苷)后,胶原蛋白合成量每个孔增加8～19 ng/μg。

表1 白头翁皂苷酶解产物促进胶原蛋白生成的量(n=6)

Tab.1 Quantity of collagen improved by hydrolysates of pulsatilla saponins

通过表1计算得到的白头翁皂苷酶解产物促进纤维芽细胞I型胶原蛋白合成能力,结果见表2。由表2结果可知,添加0.1 μg/mL白头翁皂苷酶解产物后,胶原蛋白的合成能力提高了24%左右；添加物增大到1.0 μg/mL后,胶原蛋白的合成能力没有再次明显提高,仅提高了21%左右；添加物增大到10.0 μg/mL,胶原蛋白的合成能力明显提高了51%左右。以上结果说明,添加白头翁皂苷酶解产物后,胶原蛋白的量与没有添加的情况相比有了明显的增加。

表2 白头翁皂苷酶解产物对纤维芽细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的促进作用(n=6)

Tab.2 Promoting effect of hydrolysates of pulsatilla saponins on synthesis of Ⅰ type collagen

2.2 白头翁皂苷酶解产物应用于化妆品的试验结果

为了了解白头翁皂苷酶解产物可以应用于化妆品的可能性,将其与常用的化妆品添加剂混合配制成化妆品,以20～30岁男女各10人作为受试者进行人体皮肤搽试试验。化妆品主要成分见表3。

表3 含白头翁皂苷酶解产物化妆品的主要成分

Tab.3 Composition of cosmetic containing hydrolysates of pulsatilla saponins

化妆品配方中主要还有丙烯酸酯、黄原胶、1,3-丁二醇、透明质酸钠、精制水、精氨酸等成分。将化妆品在人体手臂上进行搽试,每天2次,试用2周后并未出现不良反应,说明白头翁皂苷的酶解产物可以应用于抗皮肤老化的化妆品。

3 结 论

白头翁皂苷的酶解产物对纤维芽细胞的胶原蛋白的合成具有促进作用,添加了白头翁皂苷酶解产物的化妆品没有副作用。因此,白头翁皂苷酶解产物可以应用于抗皮肤老化的化妆品。

[1] 金凤燮. 天然产物生物转化[M]. 北京:化学工业出版社, 2009:123.

[2] 国家药典编委会. 中华人民共和国药典[M]. 北京:中国医药科技出版社, 2010:96.

[3] 王伟,李红捷,鱼红闪,等. 白头翁皂苷及次生物的研究[J]. 安徽农业科学, 2007, 35(28):8779-8780.

[4] XU Q M, SHU Z, HE W J, et al. Antitumor activity of Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo.[J]. Phytomedicine, 2012, 19:293-300.

[5] 刘显军,陈静,尚丽娟. 白头翁皂苷的提取及抑菌活性试验[J]. 中国兽医杂志, 2012, 48(1):69-70.

[6] 骆丹,许阳. 皮肤光老化的诊治进展[J]. 皮肤病与性病, 2012, 34(1):20-24.

[7] 张良芬. 外用维生素A 在皮肤科的重新应用[J]. 国外医学皮肤性病学分册, 2001, 27(5):301-302.

[8] 王昱琳. 胶原蛋白在化妆品中的应用研究进展[J]. 明胶科学与技术, 2012, 32(1):8-12.

[9] 王伟,唐正军,鱼红闪,等. 白头翁皂苷酶解产物的分离纯化[J]. 大连轻工业学院学报, 2005, 24(1):4-7.

(WANG Wei, TANG Zhengjun, YU Hongshan, et al. Seperation and purification of pulsatilla saponin products by gradient elution and enzyme hydrolysis[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2005, 24(1):4-7.)

[10] 张小愚,王伟,刘琳,等. 单糖基白头翁皂苷的分离纯化[J]. 大连轻工业学院学报, 2006, 25(2):79-82.

(ZHANG Xiaoyu, WANG Wei, LIU Lin, et al. Separation and purification of monosaccharide pulsatilla saponin[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(2):79-82.)

[11] LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193:265-275.