种植材料表面飞秒激光掺银改性的抗菌性

王 瑞 周延民 (吉林大学口腔医院预防口腔科，吉林 长春 130021)

近年来，越来越多的人采用种植牙技术修复缺失牙，而导致种植失败的原因多是由于种植体周围感染。通过在种植体表面修饰抗菌剂或制备功能性涂层作为抗菌元素的载体等方法可降低种植体周围感染的发生率，但存在操作复杂、涂层易脱落、抗菌性不稳定等缺点。本研究拟采用简单有效的方法提高种植材料抗菌性能，为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 牙龈卟啉单胞菌P.g由吉林大学口腔医院生物实验室提供，钛合金Ti-6Al-4V圆片(陕西宝钛集团)，钛:蓝宝石飞秒激光放大器(Solstice，美国 spectra-physics公司)，扫描电子显微镜(JSM-6700F，日本JEOL电子公司)，荧光显微镜(Olympus公司，日本)，超净工作台(苏州空气仪器厂)，厌氧培养箱(义乌冷冻厂产DY-1型)。

1.2 材料的制备及表征 实验所用钛片为直径8 mm，厚度1 mm的圆片。在激光作用之前，样品经过抛光处理，依次用丙酮、乙醇、去离子水清洗，然后利用真空镀膜仪在样品表面蒸镀一定厚度的金属银，随后将清洗后的钛片表面用钛:蓝宝石飞秒激光放大器进行处理，脉冲宽度为100飞秒，中心波长为800 nm，重复频率为1 kHz，通过焦距为180 mm的凸透镜将激光聚焦在样品上，能量密度分别为1.4 J/cm2，扫描速度为1 mm/s，激光处理后的样品依次用丙酮、乙醇和去离子水中超声处理。飞秒激光掺杂金属银的含量随蒸镀银的厚度增加而增加。样品分为7组，依激光蒸镀银厚度分别命名为Ag-Ti-0 nm，Ag-Ti-25 nm，Ag-Ti-100 nm，Ag-Ti-200 nm，Ag-Ti-300 nm，Ag-Ti-400 nm和Ag-Ti-500 nm组。

1.3 牙龈卟啉单胞菌的复苏与培养 选择P.g模式株ATCC33277作为实验菌株。复苏实验菌冻干株接种于脑心浸液-辅助培养基(BHI-S)血琼脂平板上，在37℃厌氧培养箱内(80%N2、10%CO2、10%H2)72 h，Gram 染色检查为纯培养物，接种于BHI-血琼脂平板上厌氧培养48 h，经鉴定后的培养物用pH7.2的0.2 mmol/ml磷酸盐缓冲液配成细菌悬液(1×109CFU/ml)备用。

1.4 抑菌试验 将P.g悬液(1×109CFU/ml)以BHI液体培养基稀释成1×106CFU/ml的菌悬液。将钛片置于75%的酒精中浸泡30 min后，经紫外线消毒1 h。无菌48孔反应板中分别放入各实验组钛片，每孔中各加入稀释后的菌悬液1 ml，放入37℃厌氧培养箱内培养48 h。将48孔板中的各组钛片取出，将48孔反应板中的液体充分震荡均匀并稀释。分别取100 μl各样本的稀释液用L棒涂布于新鲜配制的BHI-S琼脂板上，37℃厌氧培养箱内培养5天，观察培养基表面的菌落形态并计数。

1.5 细菌增殖率的检测 将各实验组钛片在75%酒精中浸泡30 min后，在超净台内将各实验组钛片用紫外灯正反两面各照射30 min。将P.g悬液(1×109CFU/ml)以BHI液体培养基稀释成1×106CFU/ml的菌悬液。把实验组的钛片分别放入消毒高压过得离心管内，然后分别每个离心管中加入10 ml 1×106CFU/ml菌悬液，37℃厌氧培养箱内培养。分别在1、3、5、7 d时，用紫外分光光度仪波长600 nm处测吸光度值(A值)，并记录。

1.6 统计学分析 采用SPSS11.0进行分析。

2 结果

2.1 P.g菌落的形态学观察及计数结果 对照组和Ag-Ti-0 nm组形成的菌落呈圆形，数量多，分别为1 772、1 748，，遍布于培养基的表面，菌落的形态较小;Ag-Ti-25 nm、Ag-Ti-100 nm、Ag-Ti-200 nm、Ag-Ti-300 nm组，菌落的数量随着蒸镀银层的厚度增加而逐渐减少，分别为900、640、588、228，单个菌落的形态逐渐增大;Ag-Ti-400 nm组菌落的数量(156)较前几组明显减少;在Ag-Ti-500 nm组几乎没有肉眼可见的菌落。见图1。

2.2 飞秒激光掺银改性后对P.g生长的影响 在1、3、5、7 d时，各组的A值均随着掺银层厚度的增加而逐渐降低，说明抗菌能力随着掺银量的增加而增强。在1 d时，各组之间的A值无统计差异;在3、5、7 d时，差异显著，Ag-Ti-500 nm组A值均显著低于其他各组(P＜0.05)，说明Ag-Ti-500 nm组的抗菌能力更强。在3 d时各组的A值均低于1 d时各组的A值，但在5、7 d时A值逐渐增高。见表1。

图1 不同实验组形成的牙龈卟啉单胞菌的菌落形态及数量

表1 各组1、3、5、7 d A 值

3 讨论

骨整合的概念首先由Brånemark提出，对于种植体的长期成功很重要。但细菌的存在可能使整合的过程复杂化，细菌很容易在种植体的表面黏附和增殖，导致种植体因感染而失败。通过在术前调整种植体表面的抗菌性，术后感染可以被克服。

通过表面形貌的改变可以调节细菌的黏附，Whitehead等〔2〕研究了细菌在有0.5～2 μm直径凹坑材料表面的黏附，发现细菌在相对粗糙表面的黏附增多。而Hilbert等〔3，4〕的研究结果表明，粗糙度的变化并没有对细菌黏附、增殖和分化有任何影响，细菌附着力不与表面粗糙度的增加有关。另一种抑制细菌黏附的方法是用高度水和分子修饰表面。最常用的亲水涂料是乙二醇或聚环氧乙烷〔5，6〕，然而，这种亲水表面也抑制哺乳动物细胞的黏附〔7〕。除了抗黏附聚合物，杀菌化合物被用来改性植入表面以减少感染的风险，如庆大霉素〔8〕、壳聚糖〔9〕。最近，银被用于各种医疗应用中〔10，11〕。将银掺杂在某些材料中在种植材料的表面制作成复合材料涂层，如与羟基磷灰石掺杂通过电化学沉积在钛表面形成带有抗菌性的生物活性表面〔12〕。

本研究采用电子蒸镀的方式在种植材料表面形成不同厚度的银蒸镀层，然后采用飞秒激光处理有蒸镀层的表面，在激光熔融材料表面形成微米-纳米复合结构的同时将银掺杂在表面改性层中，形成稳定的掺银微米纳米复合层，并对不同厚度掺银激光改性钛表面的抗菌性进行研究，发现随着掺银层厚度的增加培养基表面的菌落数逐渐减少，到一定厚度时菌落消失，说明掺银改性表面有抗菌性，随着掺银量的增加抗菌性逐渐增强。此研究结果在其他学者的研究中得到证实〔13〕，并认为银能引起细菌失活，主要是通过银离子黏附到微生物的DNA，防止细菌繁殖。

本实验随着时间的延长，银离子浓度的下降和细菌的耐受力增强而出现细菌增殖，但其增殖能力随着掺银量的增加而降低。本实验只是进行了抗菌性的体外实验部分，发生在体内的复杂的过程不可能完全被体外研究所复制，还需进行相关的体内实验评价其应用价值。

1 Whitehead KA，Colligon J，Verran J.Retention of microbial cells in substratum surface features of micrometer and sub-micrometer dimensions〔J〕.Colloid Surf B，2005;41:129-38.

2 Flint SH，Brooks JD，Bremer PJ.Properties of the stainless steel substrate influencing the adhesion of thermo-resistant streptococci〔J〕.J Food Eng，2000;43:235-42.

3 Hilbert LR，Bagge-Ravn D，Kold J，et al.Influence of surface roughness of stainless steel on microbial adhesion and corrosion resistance〔J〕.Int Biodeter Biodegr，2003;52:175-85.

4 Nejadnik MR，van der Mei HC，Norde W，et al.Bacterial adhesion and growth on a polymer brush-coating〔J〕.Biomaterials，2008;29(30):4117-21.

5 Saldarriaga Fernández IC，van der Mei HC，Metzger S，et al.In vitro and in vivo comparisons of staphylococcal biofilm formation on a cross-linked poly(ethylene glycol)-based polymer coating〔J〕.Acta Biomater ，2010;6(3):1119-24.

6 Subbiahdoss G，Pidhatika B，Coullerez G，et al.Bacterial biofilm formation versus mammalian cell growth on titanium based mono-and bi-functional coatings〔J〕.Eur Cells Mater，2010;19:205-13.

7 Vester H，Wildemann B，Schmidmaier G，et al.Gentamycin delivered from a PDLLA coating of metallic implants In vivo and in vitro characterisation for local prophylaxis of implant-related osteomyelitis〔J〕.Injury Int J Care Injured，2010;41(10):1053-9.

8 Raafat D，von Bargen K，Haas A，et al.Insights into the mode of action of chitosan as an antibacterial compound〔J〕.Appl Environ Microb，2008;74(12):3764-73.

9 Blaker JJ，Nazhat SN，Boccaccini AR.Development and characterization of silver-doped bioactive glass-coated sutures for tissue engineering and wound healing applications〔J〕.Biomaterials，2004;25:1319-29.

10 Strathmann M，Wingender J.Use of an oxonol dye in combination with confocal laser scanning microscopy to monitor damage to Staphylococcus aureus cells during colonisation of silver-coated vascular grafts〔J〕.Int J Antimicrob Agents，2004;24:234-40.

11 Lu X，Zhang B，Wang Y，et al.Nano-Ag-loaded hydroxyapatite coatings on titanium surfaces by electrochemical deposition〔J〕.J R Soc Interface，2011;8(57):529-39.

12 Necula BS，van Leeuwen JP，Fratila-Apachitei LE，et al.In vitro cytotoxicity evaluation of porous TiO2-Ag antibacterial coatings for human fetal osteoblasts〔J〕.Acta Biomater，2012;8(11):4191-7.