鸡传染性法氏囊病病毒RT－PCR 检测方法的建立与应用

孙 洁，卢体康，曾少灵，杨俊兴，詹爱军，林庆燕，曹琛福，陈 兵，

廖立珊1，阮周曦1，陶 虹1，张彩虹1，刘建利1，花群义1，3，吕建强1，3，秦智锋1、2，3＊

（1.深圳出入境检验检疫局，广东深圳市518001；2.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳市518001；3.深圳市外来有害生物质检测技术研发重点实验室，广东深圳518045）

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种家禽急性、接触传染性的烈性传染病。目前本病是危害我国养禽业的主要疫病之一，呈世界性分布，以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。随着畜牧业生产和对外贸易的不断发展，我国近年来频繁引进种鸡、种蛋和家禽产品，对引进的种鸡、种蛋和家禽产品的检疫已成为动物检疫的一个重要工作。在对引进的种鸡和种蛋的进出境检疫过程中，鉴于鸡传染性法氏囊病传染方式广泛，可随蛋进行垂直传播的特性，因此，世界各国均对此病进行重点防控，是各国进出口种鸡、种蛋和家禽产品必定检疫的项目之一。世界动物卫生组织（OIE）也将此病进行收录，认为其是影响国际动物及其产品贸易的重大动物疫病［1－5］。我国农业部2009年公布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中，把本病列为二类动物传染病进行重点防控。到目前为止，我国有关鸡传染性法氏囊病的标准有2个，但缺少必要的快速分子生物学诊断方法［6－8］。近10年来，RT－PCR 和实时荧光定 量 RT－PCR 技 术 （Real－time RT－PCR，rRTPCR）在3h～4h内快速诊断田间样品方面取得了快速发展［9］。本研究借助普遍使用的分子生物学检测技术，建立了特异性快速检测IBDV的RT－PCR和rRT－PCR方法，并对田间样品进行了大量普查监测。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 传染性法氏囊病疫苗－法倍灵（IBDVBLEN），购自美国梅里亚公司；传染性法氏囊标准毒株（CJ801－BKF）由华南农业大学馈赠；传染性法氏囊病湖北分离株（IBDV－HB）、传染性法氏囊病武汉分离株（IBDV－WH）、传染性法氏囊病强毒广东分离株（IBDV －GDW）和广西分离株（IBDV－GX），新城疫病毒、马立克病病毒、传染性支气管炎病毒均为本室分离鉴定保存；禽流感病毒H5亚型抗原、禽流感病毒H7亚型抗原和禽流感病毒H9亚型抗原，购自哈尔滨兽医研究所。

1.1.2 试剂 一步法实时荧光定量RT－PCR试剂盒：AgPath－IDTMOne－Step RT－PCR Kit，ABI公司产品；一步法RT－PCR试剂盒：QIAGEN OneStep RT－PCR Kit，Qiagen公司产品；一步法 RT－PCR试剂盒：TaKaRa OneStep RT－PCR Kit，宝生物工程（大连）有限公司产品；病毒核酸抽提试剂盒：Qiagen Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司产品。

1.1.3 设备 ABI 7500HT荧光定量PCR仪，Qiagen EZ1advanced全自动核酸抽提工作站，核酸蛋白分析仪。

1.2 方法

1.2.1 引物与探针的设计 采用OIE推荐的IBDV的引物，具体如下：

针对A片段VP2基因的引物：

引物由3段序列组成：由5′端到3′端依次为通用引物M13或R13（黑体部分）序列，限制性内切酶位点（下划线部分），IBDV特异性序列（斜体部分）。M13或R13序列为多数测序反应中的测序引物，便于对PCR扩增产物测序。限制性内切酶位点的引入，使得IBDV经RT－PCR扩增后的产物可用限制性内切酶SphⅠ（引物U3）、EcoRⅠ（引物L3和＋290）、PstⅠ（引物－861）进行酶切后连入载体中。引物U3和L3分别对应Acc No X84034毒株序列片段A的657～676和1193～1212位置，引物＋226和－861分别对应Acc No AF240687毒株序列片段B中的290～311和861～883位置。A片段扩增产物为604bp，B片段扩增产物为642bp，引物扩增片段适合进行IBDV分子进化分析和流行病学研究。

将各个年代、各个毒力、各个地区的主要代表毒株的A片段VP2全基因序列下载，用bioEdit（7.0.9.0）软件，以Clusal W方式进行排列，找出IBDV最保守的21个寡核苷酸来设计探针，再在探针两侧保守区域设计特异性的上、下游引物。引物和探针采用Primer Express 2.0软件进行评价［4］。设计的引物与探针序列见表1，探针的5′端用FAM标记，探针的3′端用BHQ基团淬灭，引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成（表1）。

用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100μmol／L储存液，置－20℃或更低温度冻存。使用时引物配制成10μmol／L工作液，探针配制成5μmol／L工作液，避免多次冻融。

表1 鸡传染性法氏囊病病毒引物与探针Table 1 Primers and probes for IBDV

1.2.2 两种RT－PCR检测方法的复核与优化 参照QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明书，于全自动核酸抽提工作站中抽提IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW 和IBDVGX、新城疫病毒、马立克病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒H5、H7和H9亚型标准HI检测抗原等11株病毒的核酸和阴性对照尿囊液中的病毒核酸。

按照 OIE推荐的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR检测方法的步骤和程序，采用TaKaRa公司一步法RT－PCR检测试剂盒和Qiagen公司一步法RT－PCR检测试剂盒，对IBDVBLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW、IBDV－GX和对照病毒进行检测。

在此基础上，以TaKaRa公司一步法RT－PCR检测试剂盒，对两种RT－PCR检测方法进行优化，以建立适合我 国 的IBDV－VP2（604）－RT－PCR 和IBDV－VP1（642）－RT－PCR检测方法。

1.2.3 IBDV－VP2－rRT－PCR的建立 选取1.2.2抽提好的核酸，参照ABI公司AgPath－IDTMOne－Step RT－PCR Kit操作说明书配制荧光定量RTPCR反应液：每个25μL的反应体系中包含2×RT－PCR母液12.5μL，酶混合物1μL，10μmol／L IBDV－FP 1 μL，10 μmol／L IBDV－RP 1 μL，5μmol／L IBDV－Pb 1μL，无核酸酶的水3.5μL，RNA模板5μL。

于ABI 7500荧光PCR仪进行实时PCR扩增。反应程序如下：50℃45min；95℃10min；95℃10 s，60℃30s重复40个循环，设置60℃ 时收集FAM荧光报告基团。

1.2.4 OIE推荐的两种RT－PCR检测方法与IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法灵敏度比对 选取IBDV－BLEN弱毒疫苗株，用无核酸酶的水10倍系列稀释成1×10－1～10－10等10个稀释度，重新抽提核酸。按照 OIE推荐的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR 两 种 RT－PCR 检 测 方法，与所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR 方法进行灵敏度检测比对，确定所建立方法的灵敏度。

1.2.5 IBDV－VP2－rRT－PCR特异性试验 用建立的IBDV－VP2－rRT－PCR方法，对6株IBDV毒株进行检测，确定所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法特异性。利用本研究所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法，对实验室保存的鸡肉正常组织、鸡血清样品、火鸡肌肉组织、鸽组织、正常鸡胚尿囊液、其他家禽病毒和细菌共12份非IBDV病毒样品进行检测，进一步确定所建立方法的特异性。

1.2.6 田间试验 自2007年以来，采用所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法，对注册禽场采集18批221份样品进行鸡传染性法氏囊病毒监测。发现阳性则用鸡胚进行病毒分离鉴定和用IBDVVP2（604）－RT－PCR 和 IBDV－VP1（642）－RT－PCR检测确证。

2 结果

2.1 两种RT－PCR检测方法的优化结果

按照 OIE推荐的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR检测方法的步骤和程序，采用Qiagen公司的一步法RT－PCR检测试剂盒，IBDV－VP2（604）－RT－PCR 可以检测出604bp条带，IBDV－VP1（642）－RT－PCR 可以检测出642bp条带，但条带微弱。采用TaKaRa公司一步法RTPCR检测试剂盒，则两种RT－PCR结果均为阴性。

以Qiagen公司一步法RT－PCR检测试剂盒，对两种RT－PCR检测方法的反应条件反复进行优化，确定了最佳的反应条件为：第一步：反转录50℃45min；第二步：94℃5min（如果为热启动一步法RT－PCR试剂盒，则需要95℃15min）；第三步：94℃30s，54℃45s，72℃1min 30s，5个循环；第四步：94℃30s，64℃45s，72℃1min 30s，30个循环；第五步：72℃延伸10min。对6株IBDV毒株用优化后的方法进行检测，结果见图1。

2.2 IBDV－VP2－rRT－PCR的建立

在25μL反应体系中，在设定的反应条件下于ABI 7500荧光定量PCR仪上进行IBDV－VP2－rRT－PCR检测。在阴性对照成立的情况下，6株IBDV毒株出现特异性的实时扩增，其他禽病病毒和阴性组织样品均没出现特异性扩增，相互之间无交叉反应。6株IBDV 毒株IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV －GDW 和 IBDV－GX 的 Ct 值 分 别 为 23.93、23.55、16.46、14.28、19.53、14.37；阴性对照无扩增信号（图2）。

2.3 三种分子生物学检测方法灵敏度比较结果

将10倍系列稀释的IBDV－BLEN弱毒疫苗株，用 OIE 推 荐 的IBDV－VP2（604）－RT－PCR、IBDVVP1（642）－RT－PCR 检测方法和IBDV－VP2－rRTPCR检测方法进行测定。结果显示，所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法的灵敏度为 10－4（图3），IBDV－VP2（604）－RT－PCR 检测方法和IBDVVP1（642）－RT－PCR 检测方法的灵敏度相当，均为10－3（图4），比所建立的rRT－PCR检测方法的灵敏度低10倍。所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法 检 测 IBDV－BLEN、CJ801－BKF、IBDV－HB、IBDV－WH、IBDV－GDW 和IBDV－GX 等6株IBDV毒株的检出率为100%（6／6），无漏检现象发生。

图1 6株IBDV毒株用优化的IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR检测结果Fig.1 The results of IBDV－VP2（604）－RT－PCR and IBDV－VP1（642）－RT－PCR for 6IBDV strains

2.4 IBDV－VP2－rRT－PCR特异性试验结果

对6株IBDV毒株用建立的IBDV－VP2－rRTPCR检测方法进行检测，均能特异性地检测出6株IBDV毒株，其他家禽病毒均没有扩增结果。表明所建立的方法特异性强，相互之间无交叉反应（图2）。通过对12份非IBDV样品的检测，结果全部为阴性，表明所建立的IBDV－VP2－rRT－PCR检测方法的特异性为100%（18／18）。说明该方法特异性强，与其他检测对象无交叉反应。

图2 6株IBDV毒株IBDV－VP2－rRT－PCR检测结果Fig.2 The results of IBDV－VP2－rRT－PCR for 6IBDV strains

图3 IBDV－VP2－rRT－PCR检测IBDV－BLEN弱毒疫苗株的灵敏度测定结果Fig.3 Sensitivity of the IBDV－VP2－rRT－PC for IBDV－BLEN vaccine

2.5 田间试验结果

2007年－2011年采集注册禽场血液和组织样品18批221份田间样品进行普查监测，鸡传染性法氏囊病普查监测表明，IBDV－VP2－rRT－PCR筛选检测阳性共8份，阳性率为3.62%。样品经鸡胚尿囊膜接种后，再采用IBDV－VP2（604）－RT－PCR 和IBDV－VP1（642）－RT－PCR方法检测，结果完全相符。

3 讨论

3.1 建立传染性法氏囊病病毒分子生物学检测的意义和必要性

近年来，传染性法氏囊病的流行出现了新的特点，其临床症状呈不典型性，免疫失败现象亦非常严重，因此对本病的早期诊断就显得尤为重要。IBD的实验室常规诊断方法有琼脂糖凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒中和试验（VN）等。这些方法在特异性、敏感性和时效性等方面存在着一定的不足，不利于疫情的早期发现［10－14］。随着科学技术的发展和对IBDV的深入研究，新的诊断方法不断涌现，尤其是分子生物学诊断技术以其灵敏、快速、特异性强等优点在IBD的早期诊断中得到了广泛的应用［15－16］。本研究建立的IBDV普通 RT－PCR方法和荧光定量RT－PCR方法将为今后IBD的快速诊断、病原学研究提供了有力的工具。

图4 IBDV－VP2（604）－RT－PCR和IBDV－VP1（642）－RT－PCR检测IBDV－BLEN弱毒疫苗株的灵敏度测定结果Fig.4 Sensitivity of the IBDV－VP2（604）－RT－PCR and IBDV－VP1（642）－RT－PCR for IBDV－BLEN vaccine

3.2 IBDV－VP2－rRT－PCR与普通RT－PCR检测灵敏度和特异性比较

本研究建立的普通RT－PCR方法分别针对了IBDV的VP1和VP2基因片段中的保守序列，引物扩增片段适合进行IBDV分子进化分析和流行病学研究；IBDV－VP2－rRT－PCR方法针对 VP2基因，两种方法均可以特异性地检测IBDV，与其他病毒之间不存在交叉性。

OIE推荐的四步反应条件中PCR的扩增步骤为：94℃30s，64℃45s，72℃1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。这个反应条件采用进口的Qiagen公司的一步法RT－PCR检测试剂可以扩增出2个目的片段，但扩增效率不高，有时条带比较微弱。鉴于PCR引物人工加尾太长，如果采用太高的退火温度可能导致PCR扩增之初不能使引物与模板有效结合，导致扩增效率不高或产生非特异性扩增。为了提高特异生，所以在PCR扩增之前增加了一个低的退火温度54℃，进行5个循环的预扩增。等扩增出带有引物的片段后，再在高的退火温度64℃条件下进行扩增，结果无论是采用国产的还是进口的一步法RTPCR检测试剂盒，均可有效地扩增出相应的目的条带。

实时荧光定量PCR由于具有灵敏、准确、快速的特点而被国内外广泛应用于人医的临床检测和兽医的临床诊断。目前，实时荧光定量PCR检测方法已在农业系统、检验检疫系统广泛使用。RT－PCR检测方法和实时荧光定量RT－PCR检测方法虽然都可以对IBD进行确诊，相对于普通RT－PCR方法，本研究建立的IBDV－VP2－rRT－PCR方法的检测灵敏度比普通RT－PCR方法高10倍，同时摒弃了传统电泳方法，时效性更佳，实现了对IBDV的实时检测监控，为IBD的防控奠定了基础。

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