八字地老虎高毒力苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株的筛选

2013-09-20于洪春王雨薇宋龙腾邓佳佳许国庆

东北农业大学学报 2013年10期

于洪春，王雨薇，宋龙腾，邓佳佳，许国庆

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.辽宁省农业科学院植物保护研究所，沈阳 110161）

八字地老虎（Xestia c-nigrum）属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），分布于世界各地，是地老虎的重要种类之一，也是黑龙江省最常发生的一种地老虎害虫，其寄主范围广泛，对蔬菜、甜菜、烟草、马铃薯、豆类、玉米、林木等植物幼苗均可造成危害[1-3]。

目前国内对地老虎的防治仍以化学防治为主，生物防治报道较少。现有八字地老虎生物防治报道主要限于八字地老虎核型多角体病毒研究[4-7]，而苏云金杆菌（Bt）对八字地老虎研究目前还未见报道。由于苏云金杆菌是应用最广泛的昆虫病原微生物之一，且其株系丰富，含有的杀虫晶体蛋白基因有较大差异，因此杀虫谱范围会存在较大不同。

文章通过50株Bt菌株对八字地老虎幼虫室内的生物测定，以期筛选出对八字地老虎幼虫有较高毒力的Bt菌株，为研制和开发防治地老虎的生物制剂提供依据，为八字地老虎的生物防治开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫与食料

供试昆虫来自于东北农业大学园艺试验站内黑光灯下诱集的八字地老虎成虫卵孵化出的幼虫。食料为新鲜白菜（Brassica chinensis L.）叶片。

1.1.2 供试菌株

供试菌株由东北农业大学农学院植物保护系害虫生物防治研究室提供，共50株Bt菌株。

1.1.3 培养基

Bt培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂2%，pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养与芽孢计数

采用试管斜面接种培养法，在28°C培养箱培养72 h后，用无菌蒸馏水将苏云金杆菌制成悬浮液，用血球计数板计数芽孢数，每菌株计数3次重复，以求得每小格芽孢数的平均数。

各个菌株芽孢浓度（cfu·mL-1）=每小格内芽孢数平均数×4×106；

各个菌株原液芽孢浓度（cfu·mL-1）=每小格内芽孢数平均数×4×106×稀释倍数。

1.2.2 生物测定

室内生物测定方法采用白菜浸渍法[8]，将新鲜白菜叶分别浸泡在50株芽孢浓度均为1×107cfu·mL-1的Bt菌液中，待整个叶片全部沾有菌液时取出，阴干之后饲喂4日龄八字地老虎幼虫，并设清水为对照。每处理设3次重复，每重复20头幼虫。幼虫饲养在25°C，相对湿度70%，光周期L14∶D10的人工气候箱中。每天更换1次新鲜无毒食料，并记录死亡虫数。在菌液处理72、120和168 h后分别计算死亡率和校正死亡率。

死亡率（%）=（试虫总数-活虫数）/试虫总数×100；

校正死亡率（%）=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100。

在初筛试验基础上，选择校正死亡率较高的Bt菌株 5株，分别将其配制成 5×108、1×108、2×107、4×106、8×105cfu·mL-1等5个不同浓度的菌液，并设清水为对照，按前述方法对5日龄八字地老虎幼虫进行生物测定，计算在菌液处理后1、3、5、7、9、10 d幼虫的死亡率和校正死亡率。以菌液浓度、处理时间（d）与累计校正死亡率为参数，用DPS v7.0.5软件进行生物测定数据处理（对数转换）与分析，获得八字地老虎幼虫5、7、10 d的浓度与校正死亡率的毒力回归方程，求出各菌株LC50值；同时获得各菌株在浓度5×108、1×108cfu·mL-1时的死亡时间与校正死亡率的回归方程，求出各菌株的LT50、LT70和LT90。通过参数比较，筛选出毒力最强的Bt菌株。

2 结果与分析

2.1 对八字地老虎高毒力Bt菌株初步筛选

50株Bt菌株以浓度为1×107cfu·mL-1的菌液处理4日龄八字地老虎幼虫，在72、120、168 h的死亡率和校正死亡率见表1。

用DPS v7.05软件对上述试验结果经差异显著性分析，结果表明，各供试Bt菌株在72 h（df=49，F=12.419，P=0.0001＜0.01）、120 h（df=49，F=11.408，P=0.0001＜0.01）、168 h（df=49，F=5.849，P=0.0001＜0.01）对八字地老虎幼虫的校正死亡率差异均达极显著水平，证实苏云金杆菌不同菌株对八字地老虎幼虫的毒力存在很大差异，其72 h校正死亡率为0～48.3%，120 h校正死亡率为-1.7%～93.2%，168 h校正死亡率为-25%～100%。根据生物测定结果，初步筛选出5株对八字地老虎幼虫具有较高毒力的苏云金杆菌菌株Bt15、Bt43、Bt47、Bt65和Bt66，其对八字地老虎幼虫在120 h校正死亡率为52.5%～93.2%，168 h校正死亡率为91.6%～100%。

2.2 对八字地老虎高毒力Bt菌株的进一步筛选

将初步筛选出毒力较高的Bt15、Bt43、Bt47、Bt65和Bt66分别等比稀释成5个不同浓度，对5日龄八字地老虎幼虫进行室内生物测定，试验结果见表2。

表1 50株Bt菌株对4日龄八字地老虎幼虫的毒力初步测定Table1 Preliminary determination of virulence of 50 Bt strains to larvae of 4 day-old Xestia c-nigrum

续表

表2 5株Bt菌株对八字地老虎幼虫的致死浓度Table2 Median lethal concentration of five Bt strains to 5 day-old larvae of Xestia c-nigrum

从表2可以看出，初筛获得的5株Bt菌株在第5天、7天、10天的校正死亡率随芽孢浓度升高而升高，随浓度降低而降低。方差分析结果表明，同一Bt菌株中，高浓度与低浓度对八字地老虎幼虫校正死亡率达极显著差异（P＜0.01）。

以上述5株Bt菌株浓度的对数和校正死亡率为参数，用DPS v7.0.5软件进行生物测定数据处理（对数转换）与分析，获得其对八字地老虎5日龄幼虫5、7、10 d的毒力回归方程分别为：菌株Bt15，y=28.61353x-177.58825，r=0.944799； y=37.42650x-226.25199，r=0.983670； y=36.72547x-206.81374，r=0.931267；菌株 Bt43，y=13.83464x-72.68714，r=0.741509； y=31.00276x-180.03209，r=0.946692；y=35.28048x-198.24387，r=0.944261；菌株 Bt47，y=15.25101x-89.66810，r=0.868809；y=22.17549x-125.88389，r=0.805321； y=32.44774x-183.22195，r=0.937154；菌株 Bt65，y=25.03684x-152.49472，r=0.973726； y=30.74524x-182.13192，r=0.921635；y=33.86411x-189.92291，r=0.967302；菌株 Bt66，y=20.50160x-118.34276，r=0.877489；y=24.79362x-141.01900，r=0.857041； y=35.06588x-196.35706，r=0.907212。根据获得各菌株的毒力回归方程，求出各菌株在饲喂菌液后5、7、10 d的LC50值，其结果见表2。

5株菌株在5×108、1×108cfu·mL-1浓度下校正死亡率与致死时间的回归方程和LT50、LT70和LT90值见表3。

表3结果表明，菌株Bt15对5日龄八字地老虎致死时间最短，在5×108cfu·mL-1浓度下，其LT50、LT70和LT90分别较其他4株菌株短1.02～3.33、1.81～5.58、3.72～11.85 d；在1×108cfu·mL-1浓度下，分别短0.51～1.71、0.85～4.92、1.75～16.53 d。说明菌株Bt15对八字地老虎幼虫杀虫速度优于其他Bt菌株。

表3 5株Bt菌株对5日龄八字地老虎的致死时间Table3 Lethal time of five Bt strains to 5 day-old larvae of Xestia c-nigrum

综合表2、表3结果，通过各Bt菌株LC50和LT50、LT70和LT90的比较，在初筛获得的毒力较高的5株菌株中，菌株Bt15在第5天、7天、10天的LC50值和LT50、LT70和LT90值均低于其余4株菌株，表明该菌株对八字地老虎幼虫的生物活性最强，毒力最高。因此，Bt15菌株为筛选到的防治八字地老虎幼虫的最佳Bt菌株。

3 讨论

目前，对八字地老虎的防治以采用拟除虫菊酯类和有机磷农药喷雾和土壤处理为主，生物防治研究报道较少。已有报道中，分离出的八字地老虎核型多角体病毒对八字地老虎有一定的防治效果[6-7,9]。斯氏线虫室内生物测定对八字地老虎有一定侵染力[10]。一般认为，苏云金杆菌对鳞翅目夜蛾科害虫防治效果不佳，而地老虎在昆虫分类上属于鳞翅目夜蛾科，所以苏云金杆菌防治地老虎的研究报道较少。杨建全等测定4株Bt菌株对小地老虎1龄幼虫的毒力，其毒力最高菌株校正死亡率可达66.7%，LC50=1.7152×109cfu·mL-1，并发现幼虫对Bt处理的叶片有拒食现象，幼虫增重明显低于对照[11]。束长龙等筛选并测定了不同Bt菌株对小地老虎的毒力作用，发现表达Cry2Ab杀虫蛋白的菌液对小地老虎的生长发育有明显抑制作用[12]。陆琼等进一步证实Cry2Ab对小地老虎的杀虫活性[13]。所以，从大量的不同Bt菌株中有望筛选出对地老虎有较高活性的高毒力菌株。

利用苏云金杆菌防治八字地老虎是一种可行的生物防治措施，为八字地老虎的生物防治开辟新途径。本研究建立芽孢浓度与八字地老虎幼虫死亡率和毒力的关系，但致昆虫死亡的另一主要原因是Bt杀虫晶体蛋白，因此还需深入研究杀虫晶体蛋白与毒力的相互关系，以确定所筛选菌株的基因型。

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