异丹叶大黄素下调膀胱癌细胞的细胞周期蛋白D1表达并诱导G0/G1细胞周期阻滞*

方 勇， 侯 琦， 卢 瑜

(1浙江大学医学院，附属邵逸夫医院肿瘤内科，浙江杭州310016;2中国医学科学院，协和医科大学药物研究所，北京100050;3南京军区杭州疗养院疗养二科，浙江 杭州310007)

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤［1］，无论是发病率还是死亡率均占首位，近年来发病率呈增长趋势［2］。而浸润性膀胱癌常出现威胁生命的远处器官转移，患者几乎100%死亡。因此如果能寻找到一种天然化合物，可抑制膀胱癌细胞的侵袭和转移，进而降低死亡率，这将具有极其重要的临床意义［3］。

近年来的研究已经证实了膀胱癌的发展、预后均与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)有关［4］。多项临床研究表明，膀胱肿瘤早期即存在着异常细胞周期蛋白D1的表达［4-5］。细胞周期蛋白D1的过度表达与预后不良相关，可显著降低患者术后的远期生存率［6］。细胞周期蛋白D1是一个重要的细胞周期调控蛋白，通过结合细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)、磷酸化以及失活视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，在G1到S过渡的细胞周期进程中发挥着重要作用［7］。因此，下调细胞周期蛋白D1的表达和功能成为抗肿瘤研究领域中靶向药物研究的重要热点之一。

从多种中药成份中提取出的寡聚二苯乙烯类化合物(oligostilbenes)具有多种生物学活性，尤其是抗肿瘤的活性正引起众多研究者的关注［8-9］。我们研究从植物买麻藤中提取分离的中药单体成分异丹叶大黄素(isorhapontigenin，ISO)对膀胱癌细胞的增殖、细胞周期蛋白D1表达水平、G0/G1细胞周期阻滞及迁移的影响。

材料和方法

1 材料

ISO由中国医学科学院北京协和医学院药物研究所提供，被溶解在DMSO，浓度为10 mmol/L，并进一步用DMSO稀释，最后DMSO终浓度为0.1%(V/V)进行细胞培养实验。相同浓度的DMSO(0.1%，V/V)被用来作为阴性对照。

抗CDK4、CDK6、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、P21、P53以及GAPDH抗体均购自Santa Cruz。抗P27抗体购自Abcam。新生牛血清和DMEM购自Gibco。DMSO购自Sigma，ATP生物荧光检测试剂盒购自Promega。人源性膀胱癌UMUC3细胞由美国纽约大学医学院HUANG Chuanshu教授实验室惠赠。由于UMUC3膀胱癌细胞株遗传背景和较强的转移倾向，并且高表达细胞周期蛋白D1，所以选定该细胞株进行后续的实验。

2 方法

2.1 ATP生物荧光检测法检测细胞活性 将UMUC3细胞在含有10%新生牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养，每3 d传代1次。以5×103cells/well的密度接种于96孔培养板，以不同浓度ISO(0、5、10、20、40 和 60 μmol/L)作用于细胞共 48 h。提取ATP，荧光扫描仪测定荧光强度，软件分析药物各浓度抑制率，计算IC50，绘制抑制曲线，评估药物作用。

2.2 UMUC3细胞周期蛋白D1表达的检测 采用Western blotging法检测UMUC3细胞株细胞周期蛋白D1蛋白表达情况。进行蛋白质的提取、定量和分离。转膜后先后与10 g/L脱脂奶粉、鼠抗人抗体(细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖性激酶4、细胞周期蛋白依赖性激酶6、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、P21、P27、P53和GAPDH)I抗4℃孵育过夜，过氧化物酶偶联的II抗孵育，运用ECL Western blotting kit显色并扫描实验结果。

2.3 UMUC3细胞周期蛋白D1 mRNA表达的检测收集UMUC3细胞约1×106，按TRIzolTM试剂盒说明书提取总RNA，逆转录反应体系:模板RNA 2 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，RNA 酶抑制剂(RNasin)335 nKat，Oligo dT181 μL，AMV 逆转录酶1 μL，5 × 逆转录酶缓冲液5 μL，终体积为25 μL，42℃水浴30 min，采用PubMed的Primer BLAST软件设计细胞周期蛋白D1基因PCR引物(扩增产物大小408 bp)，序列如下:上游引物 5’-GAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTG-3’，下 游 引 物 5’-GAGGGCGGATTGGAAATGAACTTC-3’。同时以 GAPDH作为内参照(扩增产物大小285 bp)，上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，MGIAS-1000凝胶成像系统扫描定量并拍照。

2.4 PI染色法和流式细胞术检测 胰酶消化并收集细胞，70%乙醇固定，4℃保存。600×g离心5 min，并用 PBS 液(含有0.5%BSA 和0.1%Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式细胞仪(Beckman Coulter)检测细胞周期DNA含量和凋亡细胞百分数。

2.5 细胞划痕实验 在6孔板中，以含10%FBS的DMEM培养UMUC3细胞直到生长到80%，以丝裂霉素处理1 h，抑制细胞的分裂。以无菌的移液器吸头划痕，用无血清的PBS洗涤3次后，去除划下的细胞，加入含1%FBS血清在37℃、5%CO2条件下培养，根据指定的时间进行拍照，直到细胞长满划痕区域。以细胞迁移分析软件(Cell Migration Analysis Software，Muscale LLC)定量分析细胞的迁移能力。

3 统计学处理

计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示。对各组之间采用t检验或方差分析，用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ISO抑制膀胱癌细胞的增殖

ISO 的化学结构是 4'-甲氧基-3，3'，5-三羟基二苯乙烯(4-methoxyresveratrol)，见图 1A，分子量为258 D。我们首先通过实验证实ISO对UMUC3细胞增殖的影响。UMUC3与不同剂量ISO(0～60 μmol/L范围)共同培养48 h后，倒置相差显微镜下观察，如图1B所示，20 μmol/L以上浓度显著抑制肿瘤细胞增殖。通过ATP生物荧光检测法检测细胞增殖活性，证实ISO抑制膀胱癌细胞呈明显剂量依赖性，UMUC3细胞株的 IC50为(22.5 ±2.8)μmol/L(n=3)，见图1C。进一步通过流式细胞术检测，5 μmol/L ISO作用48 h后可诱导细胞出现G0/G1细胞周期阻滞，但不会诱导细胞凋亡;而20 μmol/L ISO可诱导UMUC3细胞出现典型的凋亡峰(Sub-G1峰)，见图1D。

Figure 1.ISO inhibited proliferation of human bladder cancer UMUC3 cells.A:the structure of ISO.B:under phase-contrast microscope，representative images of UMUC3 cells pretreated with more than 20 μmol/L of ISO showed the inhibition of proliferation(×400).C:the UMUC3 cells were treated with different concentrations of ISO for 48 h，and followed by the detection of ATPase assay.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.D:flow cytometric analysis of cell cycle of UMUC3 cells treated with different concentrations of ISO for 48 h.20 μmol/L ISO could induce typical sub-G1(apoptosis)peak.图1 ISO可显著抑制膀胱癌UMUC3细胞的增殖

2 ISO可下调膀胱癌细胞细胞周期蛋白D1蛋白和mRNA表达

UMUC3与不同剂量(0～20 μmol/L)的 ISO培养24 h收集UMUC3细胞的蛋白质后，经Western blotting检测均可见分子量为37 kD的细胞周期蛋白D1的表达受到显著抑制(图2A)。检测其它细胞周期调控蛋白，ISO并未对CDK4、CDK6、细胞周期蛋白A 、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、P53、P21和P27等产生影响。图像分析系统表明(图2B)，5、10 和 20 μmol/L ISO 呈剂量依赖性抑制细胞周期蛋白D1蛋白表达(P＜0.01)。同时，RT-PCR检测结果显示，ISO可显著下调UMUC3细胞细胞周期蛋白D1 mRNA表达，见图2C。

Figure 2.The protein and mRNA levels of cyclin D1 could be significantly down-regulated by ISO.A:the protein expression of cyclin D1，cyclin A，cyclin B1，cyclin E，CDK4，CDK6，P53，P27 and P21 detected by Western blotting.B:the ratio of cyclin D1/GAPDH in the UMUC3 cells pretreated with ISO.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.C:the mRNA expression of cyclin D1 detected by RT-PCR.图2 ISO可下调UMUC3膀胱癌细胞周期蛋白D1蛋白和mRNA表达

3 ISO可诱导膀胱癌细胞出现G0/G1细胞周期阻滞

结合图1D和图2的结果，5 μmol/L ISO可显著性下调细胞周期蛋白D1 mRNA水平，但不会诱导细胞凋亡。因此后面的实验均采用5 μmol/L ISO进行研究。经流式细胞术检测，5 μmol/L ISO作用于膀胱癌细胞12 h和24 h后，可出现不同程度G0/G1细胞周期阻滞。与对照组(47.33%)进行比较，在没有显著诱导肿瘤细胞凋亡的情况下，可分别在12 h(58.82%)和24 h(63.942%)显著诱导细胞 G0/G1期生长停滞 (P ＜0.01)，见图3。

Figure 3.ISO induced G0/G1arrest of human bladder cancer UMUC3 cells.Exposure of UMUC3 cells to 5 μmol/L ISO led to significant induction of G0/G1growth arrest at both 12 h(47.33%vs 58.82%)and 24 h(47.33%vs 63.94%).AP:apoptosis.图3 ISO可诱导膀胱癌细胞出现G0/G1细胞周期阻滞

4 ISO可显著抑制膀胱癌细胞的迁移活性

经细胞划痕实验证明，与未加ISO预处理进行比较，5 μmol/L ISO均可在12 h和24 h显著抑制膀胱癌细胞的迁移活性(P＜0.01)，见图4。

Figure 4.ISO inhibited the migration of human bladder cancer UMUC3 cells detected by wound-healing assay.Cells were wounded and then treated with DMSO or ISO(5 μmol/L).At 0，12 and 24 h，phase-contrast pictures of the wounds at the same locations were taken and then migrated cells in the wound were counted.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.图4 ISO可显著抑制膀胱癌细胞迁移活性

讨 论

泌尿系统来源的膀胱上皮肿瘤是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤。近年来发病率呈明显上升趋势，晚期患者接受进一步化放疗的治疗效果仍不理想［10］。本研究证实，ISO可抑制膀胱癌细胞的增殖，可下调细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白水平，诱导膀胱癌细胞出现细胞G0/G1周期阻滞，并可抑制膀胱癌细胞迁移。

在我国，约25%的膀胱癌患者最终可发展为肌层浸润性膀胱癌或转移性膀胱癌。我们实验室近期的研究证实，从植物买麻藤中提取分离的中药单体成分ISO，剂量在20～60 μmol/L浓度条件下，能显著下调包括人膀胱癌细胞在内的多种肿瘤细胞X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)水平，诱导细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用［3］。在本项研究中，我们证实低浓度 ISO(5 μmol/L)不仅能抑制膀胱癌UMUC3细胞株的细胞增殖，并可有效地下调细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白质水平的表达，诱导细胞周期G0/G1期阻滞。

1991年发现细胞周期蛋白 D1，又称 PRAD1、CCND1、BCL-1，其基因位于 11q13，长约 15 kb，含 5个外显子，4个内含子，编码的蛋白含295个氨基酸残基，分子量37 kD［11］，为细胞内主要的癌基因之一。许多研究证据表明，在各种促进细胞炎性增殖的反应，包括致癌物质诱导细胞产生突变的过程中，首先可引起细胞周期的改变［12］。在肿瘤形成过程中，细胞周期蛋白D1比细胞周期蛋白D2和D3更加重要［13］。细胞周期蛋白D1对细胞周期蛋白依赖性激酶进行正调控，而周期素激酶抑制剂(cyclin kinase inhibitor，CKI)对细胞周期蛋白依赖性激酶进行负调控，一旦这种正负调控的平衡被破坏，细胞就可能异常增殖进而恶变。本研究证实ISO可下调细胞周期蛋白D1 mRNA的表达，但没有影响CDK4和CDK6表达，也没有对另一类包括P21、P27和P53等CKI蛋白产生显著影响。

细胞周期蛋白D1作为癌基因最早见于甲状旁腺癌，后被证实参与包括膀胱癌在内的多种实体瘤的分子病理机制。细胞周期蛋白D1表达并不限于某种病理类型，并且细胞周期蛋白D1在膀胱癌进展的各个阶段持续存在。曾文利等［15］证实膀胱癌组织的细胞周期蛋白D1阳性率明显高于正常膀胱黏膜和癌旁组织。细胞周期蛋白D1在癌变危险性大的良性病变、病理分级差以及浸润性膀胱癌组织内，均高表达并与预后密切相关。细胞周期蛋白D1在膀胱癌中的异常表达可能参与膀胱癌的发生、发展过程［14］。除膀胱癌外，细胞周期蛋白D1在其它多种人类肿瘤，包括乳腺癌［16］、子宫颈癌［17-18］、结肠癌［19］、前列腺癌［20］、肝癌［21］和皮肤癌［22］等均不同程度地高表达。因此，细胞周期蛋白D1是肿瘤细胞周期调控及药物治疗中潜在的治疗靶点。

例如，Li等［23］证实了在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)中，细胞周期蛋白D1表达缺陷后细胞迁移活性明显减低。本实验结果证实ISO(5 μmol/L)可显著抑制细胞周期蛋白D1表达，并通过细胞划痕实验证实可下调膀胱癌细胞的迁移，与Li等的结果相一致。目前下调或抑制细胞周期蛋白D1表达的分子生物学方法包括:细胞周期蛋白D1亚型(全长细胞周期蛋白D1)与小分子细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂PD0332991［24］、小分子干扰核糖核酸(RNA干扰)［25］、细胞周期蛋白D1基因敲除［26］和抑制糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β 活性［27］。但这些基因治疗，目前仍具有稳定性差、需要多次重复给药、细胞膜通透性差、转染效率不稳定等不足。患者的安全性受到威胁，极大限制了临床使用。

因此，本研究将为治疗膀胱癌和其它肿瘤提供新的思路和治疗策略，为进一步研究细胞周期蛋白D1在参与实体肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞G0/G1周期调控中的作用提供了新思路，也为临床采用中药单体综合治疗肿瘤提供了新的策略，尤其是对一些细胞周期蛋白D1基因高表达的肿瘤。

本研究还有不足之处，如:ISO可在mRNA和蛋白水平下调细胞周期蛋白D1表达水平，其具体机制尚不清楚;另外，ISO对细胞内细胞周期调控蛋白如CDK均未产生影响，但对其它信号转导途径如JNK/c-Jun、JAK/Stat等是否影响，这些都有待于进一步研究。

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