铜过量负荷对大鼠学习记忆功能的影响1）

方 向，鲍远程，金珊，陈怀珍

肝豆状核变性（WD）是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病[1]，除常见神经系统、肝脏损害症状外，研究发现 WD患者的一些高级神经活动记忆和智能等都受到影响，其中脑型WD患者存在有严重的记忆障碍，平均记忆商64，有轻度智能障碍，平均总智商为83.87、言语智商为92.60、操作智商为78.73，而无神经系统症状的WD患者也存在轻微记忆障碍，记忆商平均为91.75。提示铜（Cu）损害造成的神经细胞损伤对WD患者的学习记忆功能产生了一定的影响[2]。本实验通过Morris水迷宫试验，观察铜对大鼠学习记忆行为和海马区ERK阳性细胞表达的影响，为WD的基础研究及WD患者学习记忆功能障碍的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 清洁级健康3个月龄Wistar大鼠40只（安徽省实验动物中心提供），均为雄性，体重180g～200g（合格证号：SCXR－2011－002）。Morris水迷宫，北京友诚嘉业生物科技有限公司；去离子水由安徽大东方药业提供；硫酸铜、硝酸为优级纯，由合肥大药房提供；原子吸收分光光度计为北京WFX－1A型；721型分光光度计由上海第三分析仪器厂生产。

1.2 试验动物及分组 实验动物采用标准基础饲料适应性喂养1周后随机分成正常对照组、模型组，每组20只，动物于专用实验室中分笼饲养，室温保持在22℃～25℃，自然昼夜循环非直射光照下生活，自由饮水。

1.3 动物处理 对照组继续喂食标准基础饲料，模型组喂饲含硫酸铜1g／kg的粉状饲料和0.185%硫酸铜的去离子水8周（铜负荷饮食）。

1.4 行为学检测 铜负荷饮食8周后开始行为学检测，包括定位航行试验和空间探索试验，共进行6d。定位航行试验：每天2次，历时5d。开始时将平台置于水池第三象限，跟踪记录大鼠游泳轨迹，将大鼠面向池壁，记录在2min内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。空间探索试验：定位航行试验完成后撤去平台，将大鼠由任一入水点面向池壁放入水中，测定在2min内跨越平台次数。

1.5 标本采集及检测 行为学检测结束后每组随机选取10只大鼠于代谢笼中连续留取3天（72h尿液），摇匀后准确量出尿液体积，加H2SO4混匀，采用原子吸收法测定尿铜含量。

尿铜标本留取后，大鼠在2%的戊巴比妥钠腹腔麻醉下，分别留取肝、脑组织标本组织标本先用0.9%NaCl反复洗净，再用干净滤纸吸干并秤取湿重，采用湿式消化法消化定容，用原子吸收法测肝、脑组织铜元素含量。

2 结 果

2.1 两组大鼠组织Cu、24h尿铜水平比较 模型组与对照组比较肝、脑组织的Cu含量及24h尿铜水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 大鼠肝、脑组织的Cu含量及24h尿铜水平变化（±s）

表1 大鼠肝、脑组织的Cu含量及24h尿铜水平变化（±s）

组别 n 肝组织铜μg／g脑组织铜μg／g 24h尿铜mg／24h对照组 10 4.11±0.69 2.02±0.17 2.12±0.57模型组 10 25.37±0.31 3.61±0.12 3.55±0.17 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 空间探索学习记忆能力 在定位航行试验中，为随着训练次数的增加，各组大鼠的平均逃避潜伏期总体呈逐渐下降趋势，表明各组大鼠均有通过训练，对水下平台的空间定位获得认知并产生记忆的能力。模型组和对照组比较，逃避潜伏期差异有统计学意义（P＜0.01）。

在空间探索试验中，对照组大鼠大多采取直线方式搜索平台，而铜负荷模型组沿池壁搜索时间较长，2min内铜负荷组跨越平台次数明显少于对照组（P＜0.01）。详见表2。

表2 大鼠Morris水迷宫实验比较（±s）

表2 大鼠Morris水迷宫实验比较（±s）

组别 n 逃避潜伏期（s） 穿越次数（次）对照组 20 21.07±11.05 3.6±2.1模型组 20 35.63±12.07 1.2±1.1 P＜0.01 ＜0.01

3 讨 论

铜是人体必需的微量元素，而铜代谢障碍疾病WD引起过量的铜在各器官组织中沉积，则可以引起各器官功能的严重损害。学习和记忆是脑的高级神经活动之一，WD造成的铜沉积可以造成神经系统变性引起整个神经系统受累[3]，除常见的锥体外系症状外，WD患者还可以出现包括学习成绩、记忆力、注意力等在内的神经、心理功能损害的表现。铜是许多功能蛋白如过氧化物歧化酶、酪氨酸环化酶等必需的微量元素，当铜代谢失衡时可以通过对功能分子构象的直接损害和／或造成活性氧族、活性氮族的生成而造成持续的氧化应激反应和线粒体损伤而导致神经元凋亡和神经退行性变，影响了突触传导功能，引起神经行为的改变[4]。而铜沉积在肝组织中导致的隐匿性肝性脑病和／或代谢异常也可能影响患者的脑功能。

目前没有任何一种动物模型可以复制WD的所有临床特征[5]，本实验WD模型组大鼠肝、脑组织中铜水平显著高于对照组，可以确定的是铜负荷饮食可以使大鼠在肝、脑等组织中产生类似WD铜沉积过程[6]。Morris水迷宫作为评价啮齿类动物空间学习和记忆的试验方法被广泛应用于神经生物学、药学等领域的基础和实验研究[7]。本研究中通过研究Morris水迷宫中铜负荷大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数来反映其空间学习记忆能力的变化，结果表明铜负荷饮食喂养8周后，模型组大鼠与对照组大鼠比较，逃避潜伏期和跨越平台次数均存在显著差异，反映出铜负荷模型大鼠在水迷宫试验中学习定位能力显著下降，存在着明显的学习记忆功能障碍。提示铜负荷模型法在一定程度上适用于WD神经心理损害的发病机制和药物疗效评价研究。

[1]Gitlin JD.Wilson’s disease[J].Gastroenterology，2003，125（6）：1868－1877.

[2]王共强，韩永竹，杨任民，等.肝豆状核变性患者瘤体智力的神经心理学研究[J].中国临床神经科学，2005，21（7）：491－493.

[3]杨任民.肝豆状核变性的药物治疗[J].中风与神经疾病杂志，2005，22（3）：196－199.

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[5]梁秀龄.Wilson病的动物模型[J].中国临床神经科学，2003，11（1）：88－91.

[6]李毓雯，万小华，宁琴，等.铜过量负荷导致肝细胞凋亡及其对Bas、Bcl－2基因表达的影响[J].中国当代儿科杂志，2008，21（10）：42－25.

[7]Mura A，Feldon J.Spatial learning in rats is impaired after degeneration of the nigrostriatal dopaminereic system[J].Mov Disord，2003，18（8）：860－871.