同型半胱氨酸对高糖培养的人血管内皮细胞ICAM－1表达的影响

张卓伟，柳 洁，张华屏

糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死的主要原因之一，而内皮细胞的损伤是血管病变的前提。同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）作为心血管疾病的危险因素，与糖尿病血管并发症的发生、发展有一定关系。但其具体发病机制尚未阐明。研究显示可能与高血压、血流流变学、血脂紊乱、高血糖等因素有关，而有关蛋白质、氨基酸代谢异常在糖尿病血管并发症中作用的研究非常匮乏[1]。因此本研究观察HCY对体外高糖培养的人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）ECV－304活性氧的释放和细胞间黏附分子－1（ICAM－1）mRNA表达的影响，为临床早期干预高同型半胱氨酸血症提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株购自南京凯基生物合成有限公司；RPMI1640购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。D－L同型半胱氨酸、胰蛋白酶为Sigma公司产品；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。PCR试剂盒购于大连宝生物公司，引物由上海生物公司合成。其他试剂均为国产分析纯或进口分装。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和实验分组 人血管内皮细胞株用RPMI1640培养，用前加10%灭活胎牛血清。细胞置于5%的CO2培养箱中37℃孵育培养，0.25%的胰酶消化传代。分组情况，正常对照组：含RPMI1640培养液。高糖组（HG组）：培养液中含终浓度25mmol／L葡萄糖。HCY组：培养液中含终浓度5 mmol／L HCY。高糖＋HCY组：培养液中含葡萄糖25mmol／L和 HCY 5mmol／L。

1.2.2 倒置显微镜观察细胞生长状态

1.2.2.1 上清液收集及检测 ECV－304以每孔1×106接种到6孔板上，当生长至85%融合时收集上清液。按上述实验分组方法，在作用12h、24h、48h之后分别收集细胞培养上清液，离心以去除细胞碎片，－20℃保存备用，用硫代巴比妥酸法检测MDA，黄嘌呤氧化酶法检测SOD。

1.2.2.2 RT－PCR检测ICAM－1mRNA的表达水平 将ECV－304细胞接种于培养瓶中，随机分组和处理同上。处理12 h、24h、48h后分别收集各组细胞，Trizol法提取RNA，琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度仪检测260nm、280nm吸光度并求出A260／A280，结果是所提RNA值在1.8～2.0，说明纯度符合要求。进行cDNA合成，反转录后的cDNA作为PCR模板。PCR扩增引物序列。ICAM－1 长 度 为 555bp，上游引物：5′－CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG－3′，下游引物：5′－GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA－3′；内参照 GAPDH 上游引物：5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′，下游引物：5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′。PCR反应条件为：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共进行35个循环。扩增完毕后取PCR产物10μL做1.5%的琼脂凝胶电泳，凝胶图像分析仪分析，根据目的基因与内参基因电泳条带光密度的比值，进行ICAM－1mRNA表达水平的半定量分析。

1.3 统计学处理 每个实验均重复3次，每次实验至少有3个重复值。所有数据用SPSS13.0统计软件进行处理，统计学分析用多因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜下细胞形态的观察 正常人脐静脉内皮细胞形状为棱形，单层生长，呈典型的鹅卵石样镶嵌排列。5mmol／L HCY作用24h后，可见细胞普遍收缩，间隙增大，细胞变小变圆，并有片状细胞脱失区。

2.2 细胞上清液中SOD活力的测定（见表1） HCY组、HG组、HG＋HCY组在各时间点SOD活力均低于正常对照组（P＜0.01），且HG＋HCY组较HG组、HCY组降低的更明显（P＜0.01）。呈时间依赖性关系。

表1 ECV304细胞上清液SOD活力变化（±s） U／mL

表1 ECV304细胞上清液SOD活力变化（±s） U／mL

组别 n 12h 24h 48h正常对照组 3 24.602±0.446 24.026±0.197 24.038±0.066 HG组 3 22.584±1.3461） 20.145±2.4551） 16.872±1.6961）HCY组 3 21.216±2.3741） 18.665±1.3221） 14.047±6.7521）HG＋HCY组3 16.805±1.4411）2） 13.957±5.2241）2） 10.674±9.3981）2）与正常对照组相比，1）P＜0.01；与HG组HCY组相比，2）P＜0.01

2.3 细胞上清液 MDA水平的测定（见表2） HG组、HCY组、HG＋HCY组各时间点MDA水平均高于正常对照组（P＜0.01），且HG＋HCY组较HG组、HCY组升高的更明显（P＜0.01）。随时间延长，MDA水平逐渐升高（P＜0.01）。呈时间依赖性关系。

表2 ECV304细胞上清液MDA水平变化（±s） nmol／mL

表2 ECV304细胞上清液MDA水平变化（±s） nmol／mL

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2.4 测定ICAM－1mRNA 的表达（见图1、表3） ICAM－1 mRNA扩增片段长度为555bp，GAPDH扩增片段长度为452bp，对照组ECV304ICAM－1mRNA呈低表达。HG组、HCY组、HG＋HCY组ICAM－1mRNA表达显著高于同时间点对照组（P＜0.01），HG＋HCY组ICAM－1mRNA表达较HG组、HCY组增加的更明显，具有时间依赖性。

表3 HCY对ECV－304细胞ICAM－1mRNA表达的影响（±s）

表3 HCY对ECV－304细胞ICAM－1mRNA表达的影响（±s）

组别 n 12h 24h 48h正常对照组 3 0.63±0.04 0.62±0.03 0.65±0.04 HG组 3 0.81±0.031） 0.92±0.011） 0.98±0.011）HCY组 3 0.90±0.021） 0.98±0.011） 1.07±0.021）HG＋HCY组 3 1.05±0.051）2） 1.19±0.041）2） 1.32±0.051）2）与正常对照组相比，1）P＜0.01；与HG组、HCY组相比，2）P＜0.01

图1 HCY对血管内皮细胞ICAM－1mRNA表达的影响

3 讨 论

同型半胱氨酸是一种血管损伤性氨基酸[2－4]，是蛋氨酸代谢的中间产物。它的生理作用是维持体内含硫氨基酸的平衡。目前研究表明糖尿病患者HCY水平的增高是血管病变的重要危险因素。高同型半胱氨酸血症作为心血管疾病的独立危险因素已经得到普遍认同，在最近的一项研究中发现，糖尿病与非糖尿病人群的比较，高同型半胱氨酸血症是独立于其他危险因素的与预期5年死亡率相关的危险因素，而且似乎是最强的危险因素[5]。大量研究发现[6]血浆同型半胱氨酸水平升高可加速动脉粥样硬化，并出现动脉和静脉血栓形成，从而引起心脑血管疾病及周围血管疾病。

HCY致血管病变的机制不是十分清楚，国内外对大血管病变的研究认为，HCY的作用可能与血小板激活、平滑肌增生、内皮细胞功能失常、脂蛋白氧化和血黏滞度增加有关[7]。内皮损伤是导致糖尿病血管病变的重要因素。最近，有研究显示HCY作用于培养的人血管内皮细胞，通过活性氧（ROS）的大量释放，刺激NF－κB的活化，从而使ICAM－1mRNA的转录和表达上调及增强单核细胞的黏附和聚集[8]。适量的ROS是维持细胞正常生长和机体抗感染必需的，但过量的ROS可以对机体造成病理生理损害。另一项研究显示，HCY可呈时间和剂量依赖性上调单核细胞对培养的人主动脉内皮细胞的黏附，0.1mmol／L HCY可使单核细胞的黏附增加5倍，同时血管细胞黏附分子－1（VCAM－1）mRNA的表达增加5倍[9]。为进一步探讨高 HCY和高血糖两种危险因子共存的致病危险性，本研究观察高糖环境下HCY对血管内皮细胞的影响与ICAM－1表达的关系，结果显示HCY组血管内皮细胞ICAM－1mRNA表达水平是增高的，而且HG＋HCY组较HCY组和HG组增高的更明显，提示ICAM－1可能参与HCY对糖尿病血管病变的加重作用，同时HCY处理培养的血管内皮细胞，血红素加氧酶和谷胱甘肽过氧化酶的表达和活性均减弱，提示HCY可抑制细胞抗氧化能力[10]。HCY也可通过抑制细胞抗氧化酶的活性[11]，减少活性氧的清除，导致活性氧在细胞内和线粒体内聚集[12]。活性氧又通过PKC及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）使转录因子NF－κB活化，启动包括ICAM－1启动子在内的多种细胞因子及生长因子的转录，从而导致一系列靶基因的表达，最终导致细胞功能的改变，这些细胞因子组成了复杂的网络，作用于血管内皮细胞，促进血管病变的发生和发展。近年来有学者提出蛋白质同型半胱氨酸化（HcyT）在其致病中可能发挥重要作用[13]，而大量研究HcyT可能使血管内皮细胞呈剂量依赖性发生凋亡[14]。发现上述结论与本实验研究结果一致，HG＋HCY组刺激能使内皮细胞发生氧化应激，使SOD下降，MDA升高，ICAM－1mRNA表达上调，且HG＋HCY组较HCY组和HG组改变的更显著，并具有时间依赖性，提示HCY可能通过氧化应激机制上调ICAM－1的表达从而损伤血管内皮细胞。

黏附分子（adhesionmolecules）是由细胞产生、存在于细胞表面、介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子。黏附分子大多为糖蛋白，少数为糖脂，分布于细胞表面或细胞外基质中，以配体一受体相对应的形式发挥作用，导致细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞－基质－细胞之间的黏附，参与细胞的信号转导与活化、细胞的伸展和移动、细胞的生长及分化、炎症、血栓形成、肿瘤转移、创伤愈合等一系列重要生理和病理过程。ICAM－1是最重要的黏附分子之一，在体内分布较广泛，主要分布在白细胞、内皮细胞和上皮细胞等表面，但在血管内皮细胞表达最强，在正常情况下仅有少量表达，但受缺氧、炎性细胞因子、内毒素等刺激后，内皮细胞ICAM－1表达增加，其增高是内皮细胞和白细胞损害与激活的标志[15]。

综上所述，本实验研究发现5mmol／L HCY刺激能使内皮细胞发生氧化应激，SOD下降，MDA升高，同时氧化应激又能引起ICAM－1的表达上调，产生大量的黏附分子，高表达的黏附分子通过增强血流细胞的黏附，造成相应微血管的阻塞和内皮细胞损伤，从而引起糖尿病血管病变的发生，近来大量临床试验证明HCY在患者体内的浓度高低可以反映其血管损伤的程度和心血管事件发生的概率高低[16]，此外还有大量研究发现任何导致血中叶酸、维生素B12或维生素B6浓度降低的营养缺乏均会增加高HCY，而适当补充维生素B族或叶酸可降低血浆中HCY水平。因此早期干预高同型半胱氨酸血症对糖尿病患者具有重要意义。

[1]郭清华，陆菊明，秦海红，等.2型糖尿病微血管病变患者血浆同型半胱氨酸的变化及其机制的探讨[J].中国糖尿病杂志，2002，10：32－36.

[2]You HZ，Gu Y.Effects of HELP therapy on acute ischemic stroke and vascular endothelial cell function [J].Therapeutic Apheresis＆ Dialysis，2007，11（3）：171－176.

[3]Matthew T，David Oxide AM，etal.Nitrous nesthesia on plasma homocysteine and endothelial function[J].Anesthesiology，2008，109（4）：657－663.

[4]Boaz D，Veronica MD.Elevated homocysteine is associated with reduced regional left ventricular function：The multi－ethnic study of atherosclerosis[J].Circulation，2007，115（2）：180－187.

[5]Hoogeveen EK，Kostense PJ，Jakobs C，etal.Hyperhomocysteinemia increase risk of death，especially in type 2diabetes：5year follow up of the Hoom Study[J].Circulation，2000，101：1506－1511.

[6]Moriyama Y，Okamura T，Kajinami K，etal.Effects of serum B－vitamins on elevated plasma homocysteine levels associated with the muration of methylenetetrahydrofolate reductase gene in Japanese[J].Atherosclerosis，2002，164：321.

[7]傅毅，陈生弟，陆国强.高同型半胱氨酸血症与脑梗死及帕金森病关系的探讨[J].中国微循环，2003，7（4）：211－213.

[8]Postea O，Krotz F，Henger A，etal.Stereospecific and redox－sensitive increase in monocyte adhesion to endothelial cells by homocysteine[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26（3）：508－513.

[9]Silver man MD，Tumuluri RJ，Davis M，etal.Homocysteine upregulates vascular cell adhesion molecule－1expression in cultured human aortic endothelial cells and enhances monocyte adhesion[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22：587－592.

[10]Inoue I，Goto S，Matsunaga T，etal.The ligands／activators for peroxisome proliferators activated receptor alpha and PPARgamma increase Cu2＋，Zn2＋superoxide dismutase and decrease p22phox message expressions in essential endothelial cells[J].Metabolism，2001，50：3－11.

[11]Weiss N，Heydrick SJ，Postea O，etal.Influence of hyperhomocysteinemia on the cellular redox state impact on homocysteine induced endothelial dysfunction[J].Clin Chem Lab Med，2003，41：1455－1461.

[12]Heydrick SJ，Weiss N，Thomas SR，etal.L－Homocysteine and L－homocystine stereospecifically induce endothelial nitric oxide synthase－dependent lipid peroxidation in endothelial cells[J].Free Radic Biol Med，2004，36：632－640.

[13]Undas A，Perta J，Lacinski M，etal.Autoantibodies against nhomocysteinylated proteins in humans implications for atherosclerosis[J].Stroke，2004，35（6）：1299－1304.

[14]Weijun G，Juming L，Guoqing Y，etal.Effects of antioxidants on the reduction of homocysteine thiolactone－induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells[J].J Geriat Cardiol，2006，3：107－111.

[15]邹效漫，郭清华，陆菊明，等.高同型半胱氨酸血症对糖尿病肾病小鼠细胞间黏附分子－1表达的影响[J].中华糖尿病杂志，2004，12：293－296.

[16]王芝兰.同型半胱氨酸在心血管疾病中的检测意义[J].医学检验，2012，6（2）：117－118.