胎盘生长因子在宁心利肺汤干预肺动脉高压动物模型中的作用

姜红菊，张 伟，李润智，陈守强，韩有为，王 营

1 材料与方法

1.1 动物模型建立与分组 30只Wistar雄性大鼠（体重200 g～220g），适应性喂养1周后，随机选10只为正常组，另外20只按照60mg／kg野百合碱（将野百合碱溶于适量0.5mol／L的HCl中，用0.5mol／L的NaOH，将pH调整至7.4）项背部皮下注射。再随机分为治疗组及对照组，各10只，注射后第3天治疗组给予宁心利肺汤灌胃（根据人每公斤体重剂量的6.25倍给予），每天1次，对照组给予同等量的生理盐水灌胃，共6周。

1.2 压力测定 动物饲养到规定的天数后，用戊巴比妥钠35 mg／kg腹腔注射，麻醉充分后，取仰卧位，钝性分离右侧颈外静脉，在上做一横切口，将微导管（Finecross1.8F）插入，并经上腔静脉、右心房、右心室到肺动脉，导管外端通过压力换能器接电生理记录仪，记录肺动脉平均压（MPAP）、右室收缩压（RVSP）。

1.3 胎盘生长因子（PLGF）测定 压力测定完后留取静脉血0.5mL，离心留取血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA检测试剂盒）检测胎盘生长因子的含量。

1.4 右心室肥厚指数测定 大鼠放血处死，解剖胸腔取出心脏，PBS缓冲液将心脏内血液冲洗干净，沿房室沟剪去心房、主动脉和肺动脉，沿室间隔边缘分离出右室，还有左室＋室间隔，用滤纸吸干水分后称重并计算右室肥大指数＝右室／左室＋室间隔。

1.5 肺血管重构的观察 取出心脏后，生理盐水通过肺动脉冲洗剩余的血液，同时10%甲醛20cmH2O（1cmH2O＝0.098 kPa）压力下经气管注入肺中，约5min取出右肺，10%甲醛固定48h，常规石蜡包埋切片（在右中叶距肺门2mm～3mm处取材），行HE染色，应用图像采集分析系统测量肺血管直径＜300 μm管壁的相对中膜厚度（MT），计算MT%＝管壁的相对中膜厚度／外径。

1.6 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析及q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组各检测指标比较 实验过程中，治疗组大鼠死亡2只，对照组大鼠死亡1只。治疗组和对照组大鼠体重无明显差异。治疗组大鼠右室收缩压、肺动脉平均压、胎盘生长因子、右室肥大指数、直径＜300μm肺血管管壁中膜厚度及 MT%，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 3组各检测指标比较（±s）

表1 3组各检测指标比较（±s）

组别 n 体重（g） RVSP（mmHg） MPAP（mmHg）右室肥大指数（%） 管壁厚度（μm） MT（%） PLGF（ng／L）治疗组 10 390.75±11.71 38.05±3.312） 27.11±1.382） 30.78±3.712） 32.17±6.642） 17.34±0.732） 3.72±0.712）对照组 10 378.24±10.751） 65.54±4.231） 38.67±1.851） 48.23±4.661） 47.63±9.891） 23.97±5.911） 5.15±0.371）正常组 10 384.65±12.43 24.73±6.52 14.78±1.93 25.91±0.77 11.68±1.24 6.59±1.63 2.33±0.47与正常组比较，1）P＜0.05；与对照组比较，2）P＜0.05

2.2 显微镜观察 正常组肺血管管壁较薄、管腔内膜结构完整，无增生现象。对照组可见肺小动脉管壁明显增厚、管腔缩小。治疗组的变化较对照组明显减轻。

3 讨 论

肺动脉高压主要原因是肺小动脉原发病变或其他的相关疾病导致的肺血管内皮、平滑肌细胞增生，肺血管闭塞，肺动脉阻力增加。它可引起右室后负荷增加、右室肥大、右心衰。目前肺动脉高压动物模型的建立主要有慢性缺氧法、手术分流法、野百合碱注射法、肺叶切除＋野百合碱注射。本研究采用的是野百合碱注射。

野百合碱是双吡咯类生物碱，在经过肺血管床时，损伤肺血管内皮细胞，引起平滑肌细胞增生，使血管屏障受损，诱发炎性细胞的浸润及炎症反应，增加缩血管物质内皮素、血栓素A2等，降低舒血管物质6－酮－前列腺素、降钙素基因相关肽等，引起血管收缩，导致血管阻力增加、血管重构，这中间内皮细胞的损伤起了很重要的作用[1]。有很多实验证实野百合碱可以重复诱导严重的进展型肺动脉高压，本研究也给予了证实。本研究以大鼠为实验对象，给予野百合碱注射，成功地诱导了肺动脉高压大鼠模型，治疗组、对照组注射野百合碱6周后肺动脉平均压显著高于正常组。可见野百合碱注射可以建立肺动脉高压大鼠模型，以此模型为基础进行的研究将对肺动脉高压的临床工作提供有意义的帮助。治疗组、对照组右室收缩压显著高于正常组。肺动脉压力升高可使右室后负荷加重，引起右心室的肥大，治疗组、对照组的右室肥大指数也显著高于正常组。Blaudszun等[2]将28只大鼠随机分为两组，一组注射野百合碱60mg／kg，4周后发现右室肥厚、收缩压的升高及肺动脉高压。同样野百合碱成功诱导肺动脉高压大鼠模型也见于Zapata－Sudo等[3]的报道。

本研究中野百合碱注射后大鼠直径＜300μm肺血管管壁中膜厚度及管壁的相对中膜厚度占血管外径的百分比都明显高于正常大鼠，可见注射了野百合碱后大鼠的肺动脉发生了结构重构，出现了肺动脉的增生和肥厚。Zhao等[4]对猪腹腔注射野百合碱10mg／kg4个月～4.5个月，4周、8周后观察到肺动脉高压及其肺动脉的管壁中膜厚度的增加。提示野百合碱还可以成功建立猪的肺动脉高压模型。

宁心利肺方由黄芪、麦冬、五味子、川芎、丹参、葶苈子、车前子、冬瓜皮、益母草、泽兰、木香、生甘草组成。此方中黄芪健脾补虚，麦冬养阴生津，五味子敛阴益气，3药相合，使气复津生，汗止阴存，气充脉复。丹参、川芎活血化瘀使血行畅通，葶苈子、泽泻、冬瓜皮泄肺利水，车前子、益母草活血利水。水在胸胁用葶苈子，因其素有“治肺经阳分气闭”之功能，其“行气祛瘀，泻肺利水”效果显著。补气之中使用理气之品木香，使全方补而不滞。炙甘草调和诸药，从而达到气复、血行水去，故不治痰而痰自去，不平喘而喘自平。本研究将它运用于肺动脉高压大鼠，结果治疗组右室收缩压、肺动脉平均压、胎盘生长因子、右室肥大指数、直径＜300μm肺血管管壁中膜厚度及MT%较对照组明显下降。可见此方对肺动脉高压的有明显疗效。

胎盘生长因子属于血管内皮生长因子家族，不仅控制血管生成，也精细调整炎症反应。它能够刺激肺血管平滑肌细胞核内皮细胞的增殖分化，引起血管的新生，加上它的促炎症作用，引起血管重构[5]。本研究证实肺动脉高压小鼠PLGF是增加的，也证实了它与肺动脉高压存在相关性，并且宁心利肺汤治疗后明显下降，说明宁心利肺汤可以降低肺动脉高压大鼠的肺动脉压可能与对PLGF的影响有关。

[1]Tyler RC，Muramatsu M，Abman SH，etal.Variable expression of endothelial NO synthase in three forms of rat pulmary hypertension[J].Am J Physiol，1999，276（2pt 1）：297－303.

[2]Blaudszun GT，Morel DR.Superiority of desflurance over sevoflurance and isoflurane in the presence of pressure－overload right ventricle hapertrophy in rats[J].Anesthesiology，2012，117（5）：1051－1061.

[3]Zapata－Sudo G，Pontes LB，Silva JS，etal.Benzenesulfonamide attenuates onocrotaline－induced pulmonary arterial hypertension in a rat model[J].Eur J Phamacol，2012，690（1－3）：176－182.

[4]Zhao J，Liu R，Li H，etal.Pathological changes of monocrotalineinduced pulmary hypertension in miniature pigs[J].Journal of Southern Medical University，2012，32（6）：867－869.

[5]Tuder RM，Cool CD，Yeager M，etal.The pathobiology of pulmo nary hypertension endothetium[J].Clin Chest Med，2001，22：405－418.