bFGF分析方法学及其稳定性考察

刘慧娜 王玮

1 仪器与试药

碱性成纤维生长因子冻干粉剂(暨南大学生物研究中心)，碱性成纤维生长因子试剂盒(上海麦莎生物有限公司购买进口分装)，pHS-25型数显酸度计(上海天达仪器有限公司)，TGL-165型冷冻高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，CL-3型恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)，Bio-Tek-ModeL酶标分析仪(美国)，AB135-S电子天平(瑞士梅特勒-托利多)，101型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)，BD-239LT型低温冷柜(山东海尔集团)

2 方法

2.1 碱性成纤维细胞生长因子的理化性质［1，2］碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种非常不稳定的多肽，其冻干粉剂为类白色粉末，易溶于水，不溶于二氯甲烷、丙酮、氯仿等有机溶剂中，弱酸性及碱性环境、有机溶剂的存在等都会导致活性丧失。bFGF的等电点pI=9.6，偏碱性。bFGF有四种形式，以AUG为起始密码的相对分子质量为18000和以CUG为起始密码的相对分子质量分别为22000、22500和24000，相对分子质量为18000的bFGF是其活性的主要形式。

2.2 bFGF含量测定方法的建立

2.2.1 ELISA含量测定方法 与传统药物相比，多肽和蛋白质类药物具有种属特异性、免疫原性和非预期的多向性活性等特点，给这类药物的分析方法提出了特殊要求。优良方法的主要标志是:特异性高、灵敏度高、重现性好、回收率高、线性范围宽。现在常用的分析方法有:生物鉴定法、放射性同位素标记法和免疫学方法［3］。根据碱性成纤维生长因子的理化性质及生物学特性，本研究采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)［4］测定药物含量。

ELISA法的操作步骤:①取出酶标板，依照次序对应加入100 μL的标准品和不同稀释浓度的待测样品于空白微孔中，分别标记样品编号，阴性对照孔加入100 μL的重蒸水，并分别做复孔。然后在标准孔和样品孔中加入50 μL的酶标记溶液混合15 s，于37℃孵育反应1 h，甩去酶标板中的样品液，用稀释后的专用洗涤液清洗5次，每次静置10～20 s，每孔加入底物显色剂A和B各50 μL，于37℃下避光孵育反应15 min后，再向每孔中加入50 μL终止液，终止反应。在酶标仪上于450nm波长处测定每孔的光密度(OD)值。

2.2.2 标准曲线的制作及线性范围考察 按照酶联免疫试剂盒操作说明，取出实验所需要的微孔板条，在室温下平衡30 min。依照次序分别精密吸取不同浓度的bFGF标准品溶液各 100 μL，标准品浓度分别为 0、50、100、250、500、1000pg/ml，按2.2.1中操作方法，于450nm处测定各浓度下药物的光密度值，记录结果见表1。以B/B0%值(B=标准品OD值，B0=标准品0浓度时的OD值)对bFGF浓度C进行直线回归，并绘制标准曲线，见图1。回归方程为:

表1 λ=450nm ELISA时不同浓度bFGF标准品的测定结果

由图1可知，在0～1000pg/ml范围内，线性关系良好，bFGF的浓度与B/B0%值成定量的反比关系。

图1 标准曲线测定结果(450nm)

2.2.3 精密度考察 精密吸取bFGF标准品溶液1000、250、50pg/ml，高中低三个浓度各100 μL，按照测定方法操作，加入酶检测板微孔中，于450nm处测定bFGF的光密度，重复测定3次，结果见表2。

表2 方法精密度实验结果

由表2中结果可见，标准品溶液浓度的精密度测定结果RSD≤4%，符合药典要求。

2.2.4 回收率实验 精密吸取bFGF标准品溶液1000、250、50 pg/ml高中低三个浓度各100 μL，加入酶检测板微孔中，按照2.2.1中的测定方法操作，于450nm处测定bFGF的光密度，重复测定3次，将结果代入标准曲线计算含量及回收率，结果见表3。

表3 标准品回收率测定结果

由表3中结果可见，高中低浓度样品的回收率分别为:(100.55±0.90)%、(100.64±1.05)%、(101.16±3.68)%，说明ELISA方法的准确度较高。

3 影响稳定性的因素考察［5］

3.1 不同温度对bFGF稳定性的影响

3.1.1 取bFGF原料药分装后的样品，配制成500、250、100 pg/ml高中低浓度的超纯水溶液各三份，将其中一组样品置于 4 ～5℃冷藏条件下贮藏，分别在 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d测定bFGF的光密度，代入标准曲线方程中计算bFGF的浓度，并进行比较。结果见表4。

由表4中结果可得，bFGF水溶液的浓度在7 d内没有显著的变化，但第7天的浓度与前5日比略有降低。

3.1.2 将第二组样品溶液在冷冻条件下(-20℃)贮藏，分别在 1 d、2 d、4 d、7 d、10 d、30 d 测定 bFGF 的光密度，将数据代入标准曲线方程计算样品的浓度，并进行比较，观察样品的稳定性。结果见表5。

由表5中结果可见，bFGF水溶液的浓度在30 d内基本上没有发生变化，说明药物宜于冷冻条件下保存。

3.1.3 将第三组样品溶液于37.5℃水浴中保存，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 测定 bFGF 的光密度，将数据代入标准曲线方程计算样品的浓度，并进行比较，观察样品的稳定性。结果见表6。

由表6结果可见，bFGF在37.5℃条件下12 h后，其浓度略降低，24 h后，浓度下降明显，说明药物的活性有部分丧失。

3.2 不同pH对bFGF稳定性的影响 分别取相同体积250pg/ml的三份原料药储备液，分别与同体积 pH2.0、pH5.0、pH7.0的Tris-HCL缓冲液混和，制成三种不同pH值条件下的供试品，再分别将这种供试品4℃、15℃、37.5℃下保存，于0 h、0.5 h、1 h、2 h测定 bFGF的光密度，代入标准曲线方程计算样品的浓度，并进行比较。结果见7。

由表7中结果可以得出:在温度为4℃时，2 h内pH值对bFGF的浓度影响不是特别大，但在pH2时，1 h后其浓度稍有降低;在温度为15℃时，在2 h内药物bFGF的浓度均有所降低，且在pH2时变化相对明显;在温度为37.5时，在2 h内药物bFGF的浓度均发生了比较明显的变化，特别是在1 h后，变化更为显著，且pH值越低变化相对越大。说明同样温度下，在pH2时对药物bFGF活性的影响比pH5、7时都要明显，而温度在4℃时活性相对稳定，温度在15℃和37.5℃时，1 h后，随着pH值的降低，药物bFGF的活性均发生了不同程度的降低。

3.3 不同搅拌速度bFGF稳定性的影响 分别取500pg/ml的bFGF样品溶液一定量与pH7.6 Tris-HCL缓冲液混合后，置于磁力搅拌器上，分别于880r/min、660r/min、440r/min下，分别于不同时间0 h，0.5 h，1 h，2 h在450nm处测定bFGF的光密度，并与不同时间及不同搅拌速度的测定值进行比较。结果见表8。

由表8中数据可以得出:药物bFGF在高中低速度搅拌的情况下，在2 h内药物浓度均没有显著性的变化，说明药物bFGF的活性基本上不受搅拌速度的影响，故在2 h内高速搅拌时制备纳米粒将不会影响药物的活性。

表4 冷藏(4～5℃)保存不同时间的bFGF浓度

表5 冷冻保存不同时间的bFGF的浓度

表6 37.5℃时保存不同时间的bFGF的浓度

表7 不同温度下pH对bFGF影响的浓度

表8 不同转速下不同时间的bFGF的浓度

4 结论

4.1 由方法学考察结果可以得出:对0～1000pg/ml范围内药物的OD值进行回归分析，可得线性关系良好的直线方程，标准曲线方程为:B/B0(%)=-0.0814 c+93.404，相关系数r=0.9931，说明bFGF的浓度与结合率(B/B0%)间有定量关系，且OD值与bFGF浓度之间成良好的反比线性关系;精密度RSD≤4%，检测碱性成纤维生长因子的灵敏度达到1.0 pg/ml，说明ELISA法具有其快速、准确、特异性高、重复性好等优点，在碱性成纤维生长因子的质量控制方面，ELISA法具有优越性、实用性，便于推广。ELISA可通过抗体和抗原的特异性结合，间接反映其生物活性。因此用ELISA检测碱性成纤维生长因子的生物活性是可行的。

4.2 本研究采用ELISA法，考察了碱性成纤维生长因子不同温度、酸碱度及搅拌速度下的稳定性，为bFGF在贮藏及其制剂制备过程中药物活性的保持，使其更加有效的发挥药物作用提供参考。结果表明:药物在冷冻条件下保存最稳定，至少可以保存1个月，活性不会下降;冷藏保存不可超过7 d，提示该药制成品宜冷冻保存;在37.5℃水浴中，12 h后药物的活性略有下降，24 h后下降相对明显，故药物的水溶液在此温度下保存不宜超过12 h;在4～15℃下，pH对药物活性影响不大;搅拌速度对药物的活性也基本上没有影响。故4～15℃下，pH2.0～7.0之间以及搅拌速度880r/min在2 h内完成制备纳米粒不会破坏碱性成纤维生长因子。因此，在采用溶剂挥发法、离子交联法及乳化聚合法的制备工艺将该药制成具有一定载药量的纳米粒制剂是可行的。

［1］ 李劲松，赵涵芳，陈诗书.bFGF及其受体的研究进展．上海免疫学杂志，2002，22(5):357-360．

［2］ 刘李登，向军俭.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体研究进展，2009，25(4)379-381．

［3］ 窦晓睿，艾小霞，高荧，等．多肽类药物含量(效价)测定方法及其应用．药学进展，2011，35(12):536-542．

［4］ 向军俭，徐晓鹏，王宏，等.碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体ELISA微量检测技术．中国免疫学杂志，2006，22(4):337-241．

［5］ 李国辉，张玲，谢秋玲，等.两种类型人碱性成纤维生长因子的体外稳定性研究．中国生物工程杂志，2005，25(4):38-42．