甲胎蛋白及其单核苷酸多态性与肝细胞癌易感性的研究

吉 强， 顾 星， 高春芳

(第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科，上海 200438)

甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein，AFP)于1956年首次被发现，由Halbrecht等[1]报道其为胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种血清糖蛋白。AFP是类白蛋白家族成员蛋白之一，是一种胚胎时期或病理状态下合成的蛋白质，在生物个体发育以及肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)发生、发展中起重要作用。AFP最初在胚胎时期表达，出生后逐渐停止表达，而发生肿瘤时又开始表达。这种基因表达方式是典型的真核生物基因表达调控模型，因此，对AFP基因在胚胎肝脏和卵黄囊及肿瘤发生过程中表达方式的研究具有重要意义。AFP自发现后长期以来一直被作为肿瘤尤其是HCC的重要分子标志物用于临床诊断、治疗及预后判断。然而，对AFP的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与HCC相关性的认识远不如对AFP本身生物学功能的了解。随着近年来对AFP SNP研究的深入，发现其SNP与HCC发生、发展也存在着非常密切的关系。我们拟对AFP的分子结构、生理功能，特别是AFP SNP与HCC相关性的研究进展进行综述。

一、AFP的分子结构

AFP是一个胚胎特异的血清α-球蛋白，其基因定位于4号染色体长臂11～12区，调控区包括启动子(promoter)、沉寂子(silencer)及增强子(enhancer)。AFP的分子结构已经比较明确:是1个糖蛋白，含有1个由寡聚糖组成的糖基，相对分子质量约为68000，电泳时位于白蛋白和α1-球蛋白之间，半衰期为5 d[2]。AFP与维生素D结合蛋白、α-白蛋白和血清白蛋白同属类白蛋白家族。AFP可结合和转运大量血清配基，包括胆红素、脂肪酸、视磺酸、类固醇、染料、重金属和各种药物等，也与糖代谢、细胞骨架构成或移位有关[3]。

二、AFP的生理病理变化及临床应用

AFP的生物学功能非常错综复杂，最早报道其在人类妊娠和癌症中的生物学活性是在上世纪80年代中后期。在胚胎发育过程中，AFP的增强子始终处于激活态，而沉寂子处于抑制状态，因此，增强子的信号可以顺利到达启动子从而启动AFP基因大量表达。胎儿出生后，沉寂子活化，阻碍了增强子的启动效应，使AFP表达受到抑制。但是当HCC发生时，沉寂子再次受到抑制，使得AFP基因转录又一次激活并大量表达。随着上世纪90年代以后AFP在胎儿和肿瘤生长中的生理学作用得到进一步的证实，使得AFP在人类疾病诊断和治疗中开始发挥重要作用[4]。

AFP是胎儿血循环中的主要蛋白，结合及运输配体的功能被作为胎儿发育期间一个重要功能，主要与雌激素结合抑制母体对胎儿的免疫排斥反应，并对胎儿生长发育起调节作用。一般妇女妊娠3个月后，AFP开始高，其数值持续升高至孕30周左右达峰值，此后逐渐下降，分娩后1年内恢复正常。胎儿出生后血清中的AFP含量很快下降，8个月时AFP降至成年人水平，一般波动在1～5 ng/mL。AFP作为一个肿瘤相关的胚胎蛋白长期以来被作为检测胎儿缺陷或肿瘤发生的一个血清标志物，自从AFP应用于临床后，HCC术前确诊率明显提高[5]。AFP在正常成人血清几乎检测不到或极其微量，而在成人HCC患者中大约70% ～85%都有AFP异常表达[6]，此外有研究把AFP作为癌症预后不良的预示指标[7]。血清AFP水平的明显和持续升高与HCC的大小和恶性程度也密切相关，并且提示预后不良[8-9]。

由于AFP与HCC的发生和高死亡率密切相关，其生理及病理学作用近年来引起了广泛的关注[10-11]。在过去的十几年中，对AFP功能的研究已经取得了引人注目的进展。有体外研究表明，AFP可能通过其受体参与到多种细胞进程中，如细胞分化、生长、凋亡，细胞因子的产生，免疫抑制及肿瘤发生等方面[12]。由于分泌到循环系统的AFP能促进细胞生长，因此，其被定义为个体发育和肿瘤生长调控因子[4]。另外，AFP对多种肿瘤细胞还有双重调节生长的作用[13]。十多年前就有学者对其展开了体外研究[14]，用不同种类的肿瘤细胞和正常人胚胎成纤维细胞作为研究对象，发现剂量＞100 mg/L的AFP作用于体外培养的各种细胞，均有不同程度的生长抑制作用，但若剂量＜100 mg/L时，其对细胞的生长有明显促进作用。作为一个生长调节因子可双重调节生长，并具有剂量依赖性，这种生长调节作用可能是通过凋亡调节、胞内信号转导的调控以及使受体敏感性下降等方式实现，但其具体机制尚不清楚。

三、AFP的SNP与HCC相关性研究现状

HCC的发生是一个多因素复杂的生物学过程，在其发生、发展机制的研究中，个体是否患HCC在一定程度上取决于个体的遗传易感性，因此对宿主遗传易感性的研究越来越受到重视。对HCC患者及其亲属的研究表明，遗传因素对HCC的发病具有一定的影响，在HCC的病因中，遗传因素约占整个危险因素的五分之三[15]。

SNP作为第3代分子遗传标记，具有数量多、分布广及高度稳定性等特点，许多遗传疾病和肿瘤都与基因序列中的突变密切相关，充分反映了个体间的遗传差异，已成为目前HCC遗传易感性研究的热点[16]。SNP是基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率＞1%，人类染色体上平均每1000个碱基对中就会出现1个SNP，人类基因组中大约存在300万个SNP位点。根据其在基因中的位置，SNP可分为基因编码区SNP(coding SNP，cSNP)和基因调控区SNP(regulatory SNP，rSNP)。由于HCC发生具有显著的地区性差异，西方国家发病率相对较低，有关SNP与HCC关系的研究报道主要来自东南亚。SNP作为反映个体遗传易感性差异的重要方面，在某一恶性肿瘤人群和正常对照人群中进行SNP对比分析，可以确定SNP位点和/或其邻近变异与肿瘤发生风险的关系。

近年来，与HCC相关的SNP研究因技术的进步而更为宽泛，HCC某些特定的SNP可以通过改变基因的功能和表达影响个体对HCC的易感性，具体可能在多种途径发挥作用，能够影响HCC发病风险的SNP位点已有很多相关报道[17]，但其中AFP的SNP与HCC易感性相关研究相对较少，由于AFP的表达水平与HCC有重要关联，所以AFP的SNP与HCC易感性相关研究多集中在AFP基因表达启动调控区域。其中较早 Toyota等[18]使用限制性片段长度多态性(restriction frangment length polymorphism，RFLP)标记DNA技术发现在25个日本患者c-DNA克隆中存在多态性。接着Igarashi等[19]报道从4例患者的配对HCC组织、癌旁组织、肝纤维化组织及外周血白细胞研究中发现，其中近AFP基因启动子区域的2个位点多态性与HCC中AFP的再次表达无关，但同时也提示AFP基因存在基因多态性的现象。随着新的检测方法出现和SNP概念的明确，Chen等[20]在对 AFP的 SNP进行分析，发现其启动子区域-330、-401和-6923个位点的多态性造成AFP血清表达水平的显著改变，并且-692位点多态性与HCC易感性具有相关性。而近期Suriapranata等[21]研究了印度尼西亚人群中AFP基因上47个SNP位点后，发现有6个SNP位点与HCC及肝纤维化相关，包括1个位于基因启动子区域 (rs6834059)、4个位于第1内含子区 域 (rs3796678、rs3796677、rs3796676 和rs28532518)和1个位于第2内含子区域(rs4646038)，其中 rs6834059位点多态性中 GG基因型与HCC和肝纤维化的低发生率有显著相关性[比值比(OR)=0.167，P=0.0025 和 OR=0.181，P=0.0026]，而 rs3796678 位点多态性中AA基因型，rs3796677、rs3796676和 rs28532518位点多态性中TT基因型，rs4646038位点多态性中GA基因型与HCC有显著的相关性 (OR=6.240，P=0.0005;OR=8.18，P=0.0001;OR=5.32，P=0.0005;OR=6.26，P=0.0002 和 OR=2.26，P=0.0122)。此外，在研究了印度尼西亚人群不同基因型与AFP表达水平相关性后，发现在HCC和肝纤维化病例组都存在rs6834059位点GG基因型携带者血清AFP表达水平明显低于CC和CG基因型携带者(GG与CC型比较:P=0.028，P=0.082;GG 与 CG 型比较:P=0.011，P=0.017)，这也同该基因型与疾病相关性结果相吻合。并且进一步的研究发现2个位于第7内含子和3'UTR区域的SNP位点 (rs2298839和rs10020432)与肝纤维化易感性相关，从而提示AFP基因的遗传变异与印度尼西亚人群HCC和肝纤维化具有相关性。

四、展望

AFP是HCC发生、发展过程中特异表达的蛋白，多年来的研究表明，其具有复杂的生物学功能。AFP作为HCC的血清标志物用于临床已有几十年的历史，迄今为止，仍是特异性和敏感性最好的HCC诊断指标，广泛应用于HCC的筛查、早期诊断、预后评价、疗效观察、术后随访监测等。近年来，通过对其功能的深入研究，发现AFP并非只是一种在肿瘤发生、发展过程中的伴随蛋白分子，其在HCC细胞的生长、增殖及凋亡等过程中发挥着重要的生物学作用。除了胞外的配体结合和运输功能，以及作为生长调控因子刺激肿瘤细胞生长外，细胞内的AFP还可以通过与转录因子或一些关键蛋白之间发生相互作用而作为信号分子参与对下游基因的转录调控或对信号通路产生影响。这些为我们研究AFP在肿瘤的癌变及化疗中的影响机制提供了新的思路。此外，在某些病理情况下AFP基因表达的再次启动，是否与胎肝发育时期的表达具有相关性还有待于进一步探讨，以期为HCC的治疗提供实验及理论的基础。

[1]Halbrecht I，Klibanski C.Identification of a new normal embryonic haemoglobin[J]. Nature，1956，178(4537):794-795.

[2]Abelev GI，Lazarevich NL.Alpha-fetoprotein(AFP):solved and unsolved problems[J].McGill J Med，1996，2(2):127-134.

[3]常彬霞，辛绍杰.甲胎蛋白及其临床应用研究进展[J].世界华人消化杂志，2010，18(6):576-580.

[4]Mizejewski GJ.Therapeutic use of human alpha-fetoprotein in clinical patients:is a cancer risk involved[J].Int J Cancer，2011，128(1):239-242.

[5]Leerapun A，Suravarapu SV，Bida JP，et al.The utility of Lens culinaris agglutinin-reactive alpha-fetoprotein in the diagnosis of hepatocellular carcinoma:evaluation in a United States referral population[J].Clin Gastroenterol Hepatol，2007，5(3):394-402.

[6]Butterfield LH，Ribas A，Dissette VB，et al.A phaseⅠ/Ⅱ trial testing immunization of hepatocellular carcinoma patients with dendritic cells pulsed with four alpha-fetoprotein peptides[J].Clin Cancer Res，2006，12(9):2817-2825.

[7]Schmidt LE，Dalhoff K.Alpha-fetoprotein is a predictor of outcome in acetaminophen-induced liver injury[J].Hepatology，2005，41(1):26-31.

[8]Tangkijvanich P，Anukulkarnkusol N，Suwangool P，et al.Clinical characteristics and prognosis of hepatocellular carcinoma:analysis based on serumalpha-fetoprotein levels[J].J Clin Gastroenterol，2000，31(4):302-308.

[9]徐蓉生.肿瘤标志物在消化道肿瘤中的应用范围及临床意义[J].肿瘤预防与治疗，2008，21(3):334-337.

[10]Mizejewski GJ.Alpha-fetoprotein(AFP)-derived peptides as epitopes for hepatoma immunotherapy:a commentary[J]. Cancer Immunol Immunother，2009，58(2):159-170.

[11]Muehlemann M，Miller KD，Dauphinee M，et al.Review of growth inhibitory peptide as a biotherapeutic agent for tumor growth，adhesion，and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev，2005，24(3):441-467.

[12]Wang XW，Xie H.Alpha-fetoprotein enhances the proliferation of human hepatoma cells in vitro[J].Life Sci，1999，64(1):17-23.

[13]李国钦.甲胎蛋白的研究进展[J].中西医结合肝病杂志，2008，18(6):381-383.

[14]Dudich E，Semenkova L，Gorbatova E，et al.Growthregulative activity of human alpha-fetoprotein for different types of tumor and normal cells[J].Tumour Biol，1998，19(1):30-40.

[15]米登海，罗好曾，陈学鹏，等.肝癌遗传模式与危险因素病例-对照研究[J].中国公共卫生，2006，22(7):849-850.

[16]孙树汉，杨胜利.单核苷酸多态性与复杂性状疾病[J].第二军医大学学报，2004，25(2):117-119.

[17]顾 星，高春芳.单核苷酸多态性与原发性肝细胞癌易感性的研究进展[J].中华肝脏病杂志，2010，18(3):235-237.

[18]Toyota M，Hinoda Y，Nakano T，et al.A new restriction fragment length polymorphism of the human alphafetoprotein gene in Japanese individuals:detection of loss of heterozygosity in human hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol，1992，13(3):133-137.

[19]Igarashi K，Aoyagi Y，Ohkoshi S，et al.Sequence analysis of the proximal promoter region of the human alpha-fetoprotein gene in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett，1994，76(2-3):93-99.

[20]Chen GG，Ho RL，Wong J，et al.Single nucleotide polymorphism in the promoter region of human alphafetoprotein(AFP)gene and its significance in hepatocellular carcinoma(HCC)[J].Eur J Surg Oncol，2007，33(7):882-886.

[21]Suriapranata IM，Sudania WM，Tjong WY，et al.Alpha-fetoprotein gene polymorphisms and risk of HCC and cirrhosis[J].Clin Chim Acta，2010，411(5-6):351-358.