感染MDV鸡羽髓组织中CyP、LASP1和PCBP1蛋白的表达分析

2013-09-10谭成章张艳萍李志杰郑永胜郑惠文刘长军

中国预防兽医学报 2013年8期

谭成章，张艳萍，李志杰，郑永胜，郑惠文，刘长军*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001；2.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161）

谭成章1,2，张艳萍1，李志杰1，郑永胜1，郑惠文1，刘长军1*

本实验室前期的蛋白质组学研究显示，鸡羽髓组织中亲环素蛋白(CyP）、LIM和SH3蛋白1(LASP1）和多聚胞嘧啶结合蛋白1(PCBP1）3种蛋白为马立克氏病病毒(MDV）感染过程中差异表达蛋白。为进一步检测这3种蛋白在病毒感染过程中的表达水平，本研究以MDV GA强毒株感染SPF鸡，应用荧光定量PCR和western blot检测病毒感染14 d和21 d后这3种蛋白在羽髓组织中的表达水平。检测结果表明，病毒感染14 d后，羽髓组织中这3种蛋白的mRNA和蛋白表达水平均有不同程度的下调，其中LASP1 mRNA和PCBP1蛋白分别下调62%和48%(p<0.05）；在21 d，除CyP蛋白表达基本不变外，其他mRNA和蛋白均不同程度下调，其中LASP1蛋白下调达到46%(p<0.05）。结果表明在两个不同的MDV感染时期，MDV均可以不同程度的抑制羽髓组织中这3种蛋白的表达，本研究为进一步阐释MDV与羽髓组织的相互作用机理提供有价值的参考。

鸡；羽髓；马立克氏病病毒；LASP 1；CyP；PCBP1

鸡马立克氏病(Marek's disease，MD）是鸡的一种高传染性、肿瘤性疾病，是养禽业的主要传染病之一，其病原为MD病毒(MDV）。该病毒仅在鸡羽毛囊上皮(FFE）组织中形成带囊膜的具有感染性的完整病毒粒子并随着脱落的皮屑进行传播[1]。由于EFE组织在MDV感染、增殖和传播中的特殊意义，研究其在MDV感染过程中蛋白的转录和表达水平的变化规律，对于阐释MDV在羽髓中的复制机理有重要意义。我们的前期研究表明MDV的感染可以导致鸡羽髓组织中一系列蛋白表达发生变化[2]，本研究选取与免疫和病毒复制等密切相关的蛋白亲环素蛋白(CyP）、LIM和SH3蛋白1(LASP1）和多聚胞嘧啶结合蛋白1(PCBP1）作为研究对象，应用荧光定量PCR和western blot方法分析了这几种蛋白在感染MDV的羽髓组织中不同时间转录和蛋白表达的水平，为阐明MDV在羽髓中复制和传播机理提供了有价值的参考信息。

1 材料和方法

1.1 病毒株和实验动物 MDV GA强毒株购自美国菌种保藏中心(ATCC），由本实验室继代培养至第5代；1日龄SPF鸡购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂和仪器动物组织总RNA提取试剂盒、鼠源M-MLV反转录酶、Real Master Mix(SYBR Green）均购自天根生物公司；GAPDH、LASP1、PCBP1和CyP蛋白抗鸡兔源抗体均购自Abcam公司；红色荧光素标记的羊抗兔IgG(IgG-IRDye 700DX）购自ROCKLAND公司；NanoVue微量可见紫外分光光度计为GE公司产品；荧光定量PCR仪iQTM5为Bio-Rad公司产品；Odyssey红外荧光扫描成像系统为Li-Cor Bioscience公司产品。

1.3 引物设计及合成用于PCBP1、CyP和LASP1转录水平分析的荧光定量引物，分别参考NCBI中登录鸡的基因序列 XM_423701、XM_426283和XM_418123，用软件Primer Premier5设计并由博仕生物公司合成，GAPDH作为PCR反应中的内参，其扩增引物参考文献[3]进行合成(表1）。

1.4 动物实验将12只1日龄SPF鸡随机分为2组，每组6只。试验组以2 000 pfu/只的剂量腹腔接种MDV GA株；对照组注射等体积PBS。在相同条件下分别于负压隔离器中饲养。接种后14 d和21 d每只鸡分别采集4根～5根羽髓冻存于液氮中。

表1 荧光定量引物设计Table 1 Primers for real time PCR detection

1.5 荧光定量PCR检测对照组与感染组分别随机取4只鸡的羽髓，提取总RNA并用微量紫外分光光度计测量浓度，各取2 μg采用随机引物在20 μL的反应体积中制备cDNA。定量PCR总体系为20 μL，包括 10 μM 上下游引物各 1 μL，8 μL 2.5×Real MasterMix，2 μL cDNA 模板和 8 μL ddH2O。反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s、退火(温度见表1）15 s、68℃30 s，40个循环。以cDNA为模板5倍信比稀释作为标准品得到标准曲线，并设置阴性对照。结果采用比较Ct值相对定量方法进行处理。

1.6 We s t e r nb l o t分析取羽髓组织用SDS裂解液裂解，采用BCA蛋白定量法定量后各取50 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳。半干法转膜30 min，膜用含5%脱脂奶粉的TBS溶液在室温条件下封闭2 h，分别以抗相应蛋白的抗体(1∶1 000）为一抗，以IgG-IRDye700DX(1∶10 000）为二抗进行 western blot检测。利用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描，对照组与感染组各3个重复并用图像分析软件Quantity One对扫描图像进行蛋白检测量化分析。

1.7 数据处理全部数据采用SPSS17软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 蛋白转录水平分析结果采用荧光定量PCR方法对相关基因进行扩增，各基因扩增曲线均呈明显的S型曲线，扩增产物的熔解曲线均为单一的信号峰(图略），表明扩增产物无非特异性扩增，标准曲线的R2值均大于0.99，其中GAPDH、LASP1、CyP和PCBP1的扩增效率分别为93%、94%、98%和102%，反应结果可信。

以GAPDH作为内参基因，通过比较Ct值相对定量方法分析各基因在MDV感染组的mRNA水平。结果显示：在14 d，感染组CyP、PCBP1和LASP1 mRNA分别下调约18%、39%和62%，并且均具有统计学意义(p<0.05）；在21 d，感染组各蛋白mRNA分别下调约13%、29%和42%，而且均具有统计学意义(p<0.05）。结果表明：在这两个时间点，MDV的感染均使得羽髓中这3种蛋白mRNA的丰度水平不同程度下调(图1）。

图1 各蛋白两个时期转录水平比较分析Fig.1 The mRNA expression levels at different days post infection detected by real time PCR

2.2 蛋白表达水平分析结果 Western blot检测结果如图2所示。用图像分析软件Quantity One读取蛋白条带的光密度值，采用对应的内参GAPDH蛋白对各组数据进行归一化，进行统计分析，结果如图3所示：在14 d，感染组鸡羽髓内LASP1、CyP和PCBP1蛋白表达量相比对照组分别下调约38%(p>0.05）、3.2%(p>0.05）和 48%(p<0.05）；在 21 d，感染组各蛋白分别下调46%(p<0.05）、上调4.6%(p>0.05）和下调37%(p>0.05）。结果显示，MDV在这两个时间段不同程度抑制了LASP1和PCBP1蛋白的表达，但对CyP蛋白表达基本无影响。

3 讨论

本实验室前期研究证实，鸡在MDV接种14 d～21 d羽髓中病毒载量达到峰值并在羽毛囊上皮进行有囊膜的完整病毒的复制[4]，此外蛋白质组学研究显示，鸡羽髓组织中LASP1、PCBP1和CyP 3种蛋白为MDV感染过程中差异表达蛋白[2]，检测这3种蛋白在病毒感染过程中的表达水平，有助于进一步分析其在羽髓内的作用机理。

CyP是一类广泛存在于原核和真核生物中的多功能蛋白质，一系列研究成果表明免疫抑制作用的产生与CyP表达的降低有密切关系[5-8]。目前研究发现感染MDV鸡羽髓中IL-18、IL-6、IFN-γ和MHC-Ⅰ均上调表达，表明羽髓中抗病毒应答已充分启动，但并不能有效阻止病毒的产出性感染的原因仍很不清楚[9]。本实验检测到CyP mRNA表达在感染后14 d和21 d均出现下降，这或许是MDV具有免疫抑制作用的原因之一，该作用有可能通过下调CyP的表达而实现。采用western blot检测其蛋白表达变化不大，由于从mRNA复制到蛋白表达要经过一系列复杂过程，因此原因有待于进一步研究。

LASP1是一种肌动蛋白结合蛋白和斑联蛋白支架蛋白，在多种信号转导途径中起到结构和信号转导的承接作用，目前研究发现LASP1在促进细胞增殖及抗凋亡方面也起到重要作用[10]。本实验结果证实LASP1在感染MDV后两个时间点的羽髓组织中均是下调表达的，这也与丛锋等双向电泳结果一致[2]，表明MDV在溶细胞感染阶段对羽髓细胞可能有诱导凋亡的作用，但究竟是MDV对LASP1的直接作用导致其下调从而诱导细胞的凋亡，还是MDV通过其他途径间接影响LASP1的表达尚不清楚，或许PCBP1蛋白在其中也发挥着未知的作用。PCBP1主要参与一系列生物学过程，包括影响mRNA稳定、促进mRNA翻译和mRNA翻译沉默，在病毒复制中起到明显的抑制作用[11-12]。有研究表明疱疹病毒感染会导致PCBP蛋白显著下调，这与我们实验的结果一致[13]。我们发现鸡感染MDV后14 d和21 d，羽髓中PCBP1的表达均受到抑制，初步分析原因为MDV在感染与复制过程中影响宿主细胞PCBP1 RNA转录和蛋白表达，进而为病毒的潜伏和持续感染创造必要条件，这也可能是导致LASP1表达降低的原因；另一方面MDV病毒本身也可能通过降低PCBP1的表达而避免病毒RNA非特异性剪切，从而保证其复制周期的完成和复制完整。

本研究检测了鸡羽髓组织在MDV感染过程中CyP、LASP1和PCBP1这3种蛋白的表达，为后续研究MDV在羽髓中的作用机理和完整复制过程提供了参考依据。

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The expression of CyP,LASP1 and PCBP1 in chicken feather pulps infected by Marek's disease virus

TAN Cheng-zhang1,2,ZHANG Yan-ping1,LI Zhi-jie1,ZHENG Yong-sheng1,ZHENG Hui-wen1,LIU Chang-jun1*

(1.Division of Avian Infectious Disease,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Harbin 150001,China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China）

In order to detect the expression levels of LIM and SH3 protein 1(LASP1）,cyclophilin(CyP）and poly(C）-binding protein 1(PCBP1）in Marek's disease virus(MDV）infection process in the chicken feather follicle epithelium,SPF chickens were randomly divided into two groups,one group was infected with MDV strain GA and the others were served as negative control.The changes of mRNA level and protein expression of these 3 proteins were detected at 14 and 21 days post infection(dpi）with MDV using real-time PCR and western blot.The result showed that MDV infection resulted in downregulation of the mRNA and protein expression of these three proteins at 14 dpi,the LASP1 mRNA and PCBP1 protein express were downregulated to 62%and 48%(p<0.05）;In addition,these three mRNA and protein expression were in different degrees of reduction except CyP protein expression at 21 dpi,LASP1 protein express were downregulated to 46%(p<0.05）.These results provide valuable insights into the interactions of MDV with its host in the feather follicle epithelium.

chicken;feather follicle epithelium;MDV;LASP1;CyP;PCBP1

S852.65

1008-0589(2013）08-0603-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2013.08.01

*Correspondingauthor

2012-10-22

国家自然科学基金(31201924）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(0302012013）

谭成章(1986-），男，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事动物分子生物学研究.

*通信作者：E-mail：liucj93711@hvri.ac.cn

(本文编辑：赵晓岩）