ACE基因插入/缺失多态性与228例原发性高血压的相关性研究

张冬梅 于丽华

(1.青岛大学医学院，266021；2.济南军区青岛第一疗养院，266071)

ACE基因插入/缺失多态性与228例原发性高血压的相关性研究

张冬梅1于丽华2

(1.青岛大学医学院，266021；2.济南军区青岛第一疗养院，266071)

目的 探讨血管紧张素转化酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多态性与青岛地区原发性高血压(EH)的发生以及高血压分级间的相关性。方法 选择青岛地区EH患者228例和119例正常对照，测定两组血压、血脂、血糖等临床及生化指标，并对高血压进行分级。采用聚合酶链反应技术(PCR)，检测ACE基因型。结果 EH组与对照组相比，两组间基因型频率比较差异无统计学意义(P＞0.05)，等位基因频率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步以性别进行分层，男性EH组与男性对照组相比，基因型及等位基因分布频率差异均有统计学意义(P＜0.05)；而女性EH组与女性对照组相比，基因型及等位基因分布频率差异均无统计学意义(P＞0.05)。结合趋势检验，EH组中等位基因D与血压的分级呈正相关(P＜0.05)。结论 ACE基因等位基因D与EH的发生相关，尤其与男性EH相关，并与血压的分级相关联。

原发性高血压；血管紧张素转化酶；基因多态性

原发性高血压(essential hypertension，EH)是由环境因素、遗传因素等共同作用引起的一种复杂性疾病。肾素-血管紧张素系统(RAS)是体内调节血压和水电解质平衡的主要系统，是EH发病的重要环节。血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)作为RAS中的重要组成部分，在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的产生和缓激肽的降解中起关键作用，ACE基因则被认为是高血压的候选基因。研究表明[1]，ACE基因第16内含子的插入/缺失(I/D)多态性与EH相关联。但国内外有关此位点与EH相关性的研究结果却不尽相同[2]。基于此，本研究旨在了解青岛地区EH与ACE基因多态性的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择自2008-01—2012-03在我院首诊的EH患者228例，其中男性127例，女性101例；年龄(61.73±10.44)岁。EH的确诊符合2010年中国高血压防治指南[3]诊断标准，并根据血压水平分级，其中高血压1级103例、2级83例、3级42例。排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病、肿瘤、糖尿病、肾功能衰竭者、EH家族史者。另选择健康对照119例，其中男性68例，女性51例；年龄(60.54±9.04)岁，排除标准同上。两组均为青岛地区常驻居民，无血缘关系。所有研究对象均经详细的病史询问、体格检查。

1.2 研究方法

1.2.1 BMI、血脂、血糖的检测 测量研究对象的身高、体质量，计算身高体重指数(BMI)，按体质量(kg)/身高(m)2公式计算。隔夜禁食12 h，抽取清晨空腹静脉血4 mL，采用全自动生化分析仪检测血浆总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、载脂蛋白A、载脂蛋白B、空腹血糖。

1.2.2 基因型检测 ①DNA提取：EDTA抗凝血5 mL，使用天根生物人类基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行DNA提取，操作过程严格遵守试剂盒说明书要求。②引物设计：通过互联网Genbank数据库查找到公开发表的ACE基因序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成引物。引序列如下：正向5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′，反向5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′。③PCR扩增条件：20 μL反应体系，包括宝生物工程(大连)有限公司生产的SYBR Premix Ex Taq(2x)反应液10 μL，PCR Forward Primer(10)1 μL，PCR Reverse primer(10)1 μL，DNA模板2 μL，去离子水6 μL。94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。④ACE基因型判断及鉴定：同时PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物由南京金斯瑞生物科技公司进行基因测序，结果证实该产物与目的基因的片段长度一致。⑤ACE基因型的判断与鉴定结果：位于ACE基因内含子16的插入或缺失多态性经上述PCR方法检测后，可扩增出两种长度的片段，即490 bp的插入(I)片段和190 bp缺失(D)片段，紫外灯下可呈现下面3种带型：单一的490 bp条带(II基因型)，190 bp和490 bp两条带(ID基因型)，单一的190 bp条带(DD基因型，图1)。

图1 1为Marker；2为ID型；3，4，10为DD型；5，6，7，8，9，11为II型；12为Marker

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0软件包进行统计分析，计量资料采用表示，经Kolmogorov-Smirnov Normality检验为正态分布者，且方差齐者采用t检验；偏态分布者采用Mann-WhitneyU检验。应用χ2检验对Hardy-Weinberg平衡进行验证。等位基因和基因型频率采用基因计数法计算。组间等位基因与基因型的频率分布采用卡方检验。所有资料采用双侧检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间基线水平比较 EH组与对照组相比，总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、载脂蛋白A、载脂蛋白B、BMI、空腹血糖差异均有统计学意义(P＜0.05)，而在年龄、性别、低密度脂蛋白、吸烟史、饮酒史上，差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

表1 两组间基线水平比较

2.2 两组间基因型及等位基因分布频率比较 ACE基因型分布在两组间均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P＞0.05)，基因频率能够代表群体的基因分布。两组间基因型分布差异无统计学意义(P＞0.05)。在对照组中，等位基因I、D频率为67.2%和32.8%，在EH组中，等位基因I、D频率为57.5%和42.5%，两组间I/D等位基因分布频率差异有统计学意义(P＜0.05)。

在男性对照组中，II型、ID型、DD型频率分别为50.0%、35.3%和14.7%；而在男性EH患者组II型、ID型、DD型频率分别为31.5%、43.3%和25.2%，两组间基因型分布频率差异有统计学意义(P＜0.05)。在男性对照组中，等位基因I、D频率为67.6%和32.4%；在男性EH组中，等位基因I、D频率为53.1%和46.9%，两组间I/D等位基因分布频率差异亦存在统计学意义(P＜0.05)。

女性在两组间的基因型及等位基因分布频率差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。

2.3 EH组不同基因型的血压水平比较 在EH组中，随着血压水平的升高，等位基因D的含量逐渐增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。结合趋势相关性检验，r＝0.240、P＝0.035，表明等位基因D与高血压的分级呈正相关(表3)。

表2 两组间基因型频率及等位基因频率比较[例数(%)]

3 讨论

人类ACE基因定位于17q23，为单拷贝基因，全长21 kb，含26个外显子和25个内含子，不同种类的细胞ACE mRNA是由同一ACE基因在不同部位启动、转录而生成。在第16内含子内有一段287 bp的插入/缺失(I/D)多态性，此插入序列与人类Alu重复序列家族有同源性，根据是否存在或缺失287 bp的Alu重复序列而分为等位基因I和等位基因D，这两种等位基因组成II、ID及DD型3种基因型。本研究以中国汉族人群作为研究对象，探讨ACE基因I/D多态性与EH的相关性，结果发现等位基因D与男性EH具有相关性，与女性EH无相关性；等位基因D与高血压的分级呈正相关。

近年来，多种研究表明，ACE基因I/D多态性与EH相关，是EH发病机制一种独立的危险因素[1，4-7]，等位基因D与男性EH密切相关[8-10]。Ji等[11]对中国汉族人群EH与ACE基因多态性的关联研究进行了一项荟萃分析，最终纳入40项关于ACE I/D的研究，包括在中国的23个省和特别行政区的10 547例原发性高血压患者和9 217例对照者。结果表明，基因型DD与EH密切相关(OR：1.61，95%CI：1.16～2.03，P＝0.002)。其发生机制可能为：DD基因型血清水平ACE显著高于其他两型，这将对AngⅡ的形成和缓激肽的灭活产生作用，继而影响机体内醛固酮的分泌、水钠平衡代谢以及血管收缩和血管平滑肌增生。而这些因素均是导致EH的易发因素。其次，可能存在其他与ACE基因相连的基因对EH产生影响。但是其具体作用机制，以及DD型如何影响、诱发EH尚未可知。

但也有一些研究未发现ACE基因与EH相关[2，12]。这些矛盾的结果可能是由于EH是一个由遗传、环境因素共同作用引起的复杂性疾病。同时基因对血压的影响并不遵守简单的孟德尔遗传模型。这些互相矛盾的结果也说明了高血压单一基因研究的低效性。其次，研究正常人表明，ACE I/D多态性的基因型的分布存在种族、地域差异，其群体遗传学的特点是：白种人等位基因D分布频率高于等位基因I，黑人等位基因D分布频率高于等位基因I，而蒙古人种等位基因I分布频率高于等位基因D。这也是导致结果不一的因素之一。再次，研究表明[13]，在血压的测量上，用24 h的动态血压比偶测血压更优越，更能科学的反映研究者的实际血压情况。而大多数研究均采用偶测血压。

综上所述，本研究发现等位基因D与男性EH具有相关性，与女性EH无相关性；等位基因D与高血压的分级呈正相关。需进一步扩大样本，以验证ACE基因I/D多态性与EH发病风险的相关性。

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Objective To investigate the relationship between angiotensin converting enzyme(ACE)gene insertion/deletion polymorphism and essential hypertension(EH)and different hypertension grades in Qingdao area.Methods 228 essential hypertension sufferers and 119 people with normal blood pressure in Qingdao area were chosen to detect blood pressure，blood lipid，blood glucose and other clinical and biochemical indexes in both groups，and the blood pressure was classified into three grades.The polymerase chain reaction(PCR)technique was adopted to determine ACE gene I/D polymorphism.Results The difference of genotype frequency of ACE gene type was not of statistical significance in EH group and normal group(P＞0.05).The difference of allele frequency was of statistical significance in EH group and normal group(P＜0.05).Hierarchy was further made on the basis of gender.The difference of genotype and allele distribution frequency was of statistical significance between males in EH group and normal group(P＜0.05)，but it was not of statistical significance between females in EH group and normal group(P＞0.05).According to trend test results，the D allele is positively correlated with blood pressure grades in EH group.Conclusion The D allele of ACE is probably involved in the pathogenesis of EH in Qingdao area，especially in males，and also related to blood pressure grades.

Essential hypertension；Angiotensin converting enzyme；Gene polymorphism

1005-619X(2013)12-1059-03

济南军区科研立项课题(JN11L067)

2013-08-21)