不同散粉期胡桃楸离体花粉生活力的测定

王 非，赵舒野，姜思佳，张建瑛

(1.东北林业大学园林学院，哈尔滨 150040;2.黑龙江省森林植物园，哈尔滨 150040;3.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150040)

胡桃楸 (Juglans mandshurica)为胡桃科胡桃属植物，落叶乔木，国家二级保护植物。胡桃楸不仅木材优良，而且树形优美观赏效果好，抗性和耐性都较强，可吸收工业废气是一种优良的城市园林绿化树种。此外，胡桃楸根、茎、叶、果实中含有丰富的化学活性成分，具有较强的抗肿瘤、抗氧化、镇痛、抗炎和抗菌等作用［1］。作为植物的雄配子体［2］，花粉生活力可作为评估花粉细胞活性的主要依据，其测定结果是否准确直接决定下一步的细胞学实验和杂交授粉结实的成败。目前国内并未见到胡桃楸花粉活力测定的报道。本文开展胡桃楸花粉活力及萌发的研究，可为胡桃楸种质资源保存、利用等实验研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地点与材料

实验于2010年5月，在东北林业大学园林学院组织培养实验室完成。

胡桃楸花粉采自东北林业大学实验林场健康胡桃楸植株 (本实验胡桃楸散粉期从2010年5月2日开始散粉，至5月7日散粉结束)。每天上午10∶00采集散粉期的雄花序，用硫酸纸包好，迅速带回实验室，将花序平摊在硫酸纸上，至避风阳光下晾晒，收集花粉，立即用于活力测定。

1.2 花粉生活力检测

花粉活力检测方法采用TTC法和I－KI法［3］。

1.3 花粉萌发实验

配置浓度为10%、20%、30%、40%、50%和60%的6种蔗糖溶液，吸取少量溶液滴在载玻片上，取适量花粉撒在溶液中，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中。然后将培养皿放在恒温箱中，24 h后进行观察，取5个不同视野进行观察，每个视野观察不少于30个花粉粒。按公式 (1)计算萌发率。

花粉萌发率=(已萌发的花粉粒数÷花粉总粒数)×100%。 (1)

1.4 不同散粉期花粉萌发率统计

在胡桃楸植株整个散粉初期→散粉盛期→散粉末期的过程中，每天采集新鲜的花粉，用TTC法和I－KI法进行活力测定，以及离体萌发法进行萌发率测定。

2 结果与分析

2.1 花粉生活力

2.1.1 TTC法检测结果

在显微镜下观察到偶有花粉粒着色，且着色较淡，不容易辨别，但随着散粉时期的变化，着色率先升高后降低，可初步认为TTC法并不适用于胡桃楸花粉生活力检测。

2.1.2 I－KI法检测结果

在显微镜下观察中几乎没有花粉着色。因为I－KI能将淀粉染成蓝色，所以推测胡桃楸的花粉中积累的主要有机物质不是淀粉，需要进一步进行组织化学成分分析来确定。I－KI法较TTC法检测效果差，因此认为I－KI法也不适合胡桃楸花粉活力的测定。但随着散粉时期的变化，着色率也呈先升高后降低趋势。

2.2 花粉离体萌发观察

2.2.1 花粉萌发蔗糖溶液浓度选择

在离体培养基内有关于蔗糖浓度配方的研究很多，一般认为10%～20%适宜，但是不同植物的花粉萌发需要的适宜培养基是不同的［4］。实验结果显示在蔗糖浓度为20%时，胡桃楸花粉的萌发率最高为81.52%见表1。

表1 不同蔗糖浓度中花粉的萌发率 (%)Tab.1 Pollen germination rate at different sucrose concentration

2.2.2 花粉萌发中的表现

显微镜下观察发现花粉呈3种形式:花粉管既不萌发或萌发较短，也不释放内含物如图1(a)所示;花粉管不萌发，只释放内含物如图1(b)所示;花粉管萌发并伸长如图1(c)所示，只有花粉管萌发并伸长的类型才能被视为具有活力;可以见到花粉孔，由于观察方向及花粉位置不同的原因，可以看到每个花粉有花粉孔3～7个不等如图1(d)至图1(f)所示。

图1 显微镜下花粉的形式Fig.1 Pollen under the microscope

2.2.3 培养基萌发法测定不同散粉期花粉萌发率

记录整个散粉周期 (5月2日至7日)，即时测定花粉的萌发率并绘制变化趋势图 (如图1所示)。由表1和图2可知，在整个散粉过程中，散粉初期 (5月2日，花粉的生活力最低只有81.52%，随着散粉的进行，花粉的生活力升高至顶点 (5月6日)，然后，花粉的生活力开始下降，直至散粉终止 (5月7日)。其中5月6日是散粉量最大时期，即散粉盛期。

图2 不同散粉期胡桃楸花粉萌发率Fig.2 Pollen germination rate at different pollen dispersal periods

3 结论与讨论

本研究表明胡桃楸花粉生活力的测定方法主要是离体萌发法，最适宜的蔗糖浓度为20%，萌发率能达到81.52%，培养基制定较为简便，有利于镜检;显微镜下，胡桃楸的花粉萌发主要有3种表现形式:花粉管既不萌发或萌发较短，也不释放内含物;花粉管不萌发，只释放内含物;花粉管萌发并伸长。除了蔗糖浓度外，硼酸浓度、Ca2+浓度、气候条件以及实验设备条件等也会影响花粉萌发，试验仅为1年的观察结果，因此该试验只是对胡桃楸花粉活力的检测进行了初步探索，其他培养条件还有待于进一步研究确定。在本研究中，采用离体培养基萌发法对胡桃楸不同散粉期花粉生活力进行了检测，结果表明胡桃楸在散粉盛期时花粉的生活力较强。

前人关于花粉生活力检测的研究已有很多报道，在本研究中，初步表明TTC法不适用于胡桃楸花粉生活力测定，这和很多植物的花粉活性测定研究的结果相似，如腊梅、桂花、木槿、海风藤等均不适用于 TTC 法［2，5－7］;I－ KI法测定胡桃楸的花粉生活力的效果也不明显;而离体培养基萌发法是目前广泛应用的1种检测方法，检测结果较为精确可靠［8］，花粉活力检测指标为花粉萌发率，本实验的结果显示，胡桃楸花粉生活力检测的方法为离体培养基法，但应该通过深入研究提高花粉生活力检测的准确性。

【参 考 文 献】

［1］管小玉，曲中原，邹 翔等．胡桃楸的化学成分研究进展［J］．中草药，2009，40(S):35 －38．

［2］周莉花，郝日明，赵宏波．蜡梅花粉活力检测方法筛选及保存时间观察［J］．浙江林学院学报，2006，23(3):270 －274．

［3］于晓英．瓜叶菊花粉生活力测定［J］．湖南农业大学学报，2005(2):41－45．

［4］宋立功，周怀军，王仁娴，等．李树不同品种花粉生活力研究［J］．河北林果研究，2006，(21)1:57 －62．

［5］杨秀莲，向其柏．桂花花粉活力测定与‘晚籽银’桂柱头可授性分析［J］．林业科技开发，2007，(2l)3:22 －25．

［6］张辛华，李秀芬，张德顺，等．木槿花粉活力检测方法筛选［J］．中国农学通报，2009，25(8):227 －229．

［7］郭 庆，王德斌，王定康，等．海枫藤花粉活力的测定方法比较［J］．昆明学院学报，2009，31(3):65 ～66．

［8］李志军，丁 军，徐崇志，等．胡杨灰叶胡杨花粉成分及生活力的比较研究［J］．武汉植物学研究，2002，20(6):453 －456．