尿毒症患者血清对血管平滑肌细胞钙化及Ⅰ型胶原表达的影响

白亚玲，徐金升，牛哲哲，张俊霞，张胜雷，崔立文，张慧然

(河北医科大学第四医院，石家庄 050011)

近年来，慢性肾脏病(CKD)已成为我国常见的慢性疾病，患病率约为 10.8%［1，2］，并有逐年增高的趋势。国外统计结果表明，CKD患者是心血管疾病(CVD)发生的高危人群，而血管钙化作为CVD发生的独立危险因素，近年研究显示，CKD患者主要表现为中膜钙化，血管平滑肌细胞(VSMCs)发生类成骨/成软骨样表型转化，在血管钙化中起着极为重要的作用。2011年1月～2012年9月，我们采用尿毒症患者血清(以下简称尿毒症血清)模拟体内环境刺激VSMCs，用不同浓度尿毒症血清对VSMCs进行干预，探讨尿毒症血清诱导VSMCs钙化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2011年1月～2012年9月于河北医科大学第四医院血液净化中心行维持性血液透析的患者12例，正常健康志愿者10例，自河北医科大学实验动物中心购置清洁级SD大鼠数只，雄性，5周龄，体质量80～100 g。

1.2 试剂与仪器 兔抗鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体(美国Abcom公司)、荧光标记抗兔的二抗(Cell signaling公司)、RT-PCR反转录试剂盒(美国Fermentas公司)、凝胶成像系统FOTODYNE型(美国Image公司)、PCR仪ABI5700型(美国ABI公司)、微量核酸蛋白检测仪(美国Thermo公司)、稳压稳流电泳仪DYY-III6B(北京六一仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 取大鼠胸腹主动脉采用组织块贴壁法进行VSMCs原代培养，所有细胞均采用高磷(10 mmol/L β-甘油磷酸)培养基培养，VSMCs随机分为健康血清组和尿毒症血清组，依据血清在培养基中所占比例每组各设5%、10%、15%(低、中、高)三个亚组，干预6 d。

1.3.2 血清制备 尿毒症血清组:透析前清晨空腹采静脉血4 mL离心后，分离血清并混合，56℃灭活，0.22 μm的滤膜过滤除菌，－80℃冷冻保存备用;健康血清组:同期选取自愿参与本研究的健康志愿者，清晨空腹采静脉血4 mL，处理方法同尿毒症患者血清。依据血清在培养基中所占比例每组各设5%、10%、15%(低、中、高)三个亚组，分别干预 6 d。

1.3.3 钙化检测

1.3.3.1 钙盐沉积测定 ①茜素红染色［3］:取4～5代细胞以5×104/孔密度接种于24孔板内，干预6 d，用pH 8.4、浓度为0.1%的茜素红染液进行钙化染色，倒置显微镜下观察照相。结果判断标准:钙盐沉积为橘红色。②von Kossa染色［4］:同法接种细胞，干预后固定，行5%硝酸银避光行钙化染色，紫外线照射。倒置显微镜下观察照相。结果判断标准:钙盐沉积为黑色，背景为红色。

1.3.3.2 细胞内钙含量测定［4］取4～5代细胞以2 ×105/孔密度接种于6 孔板，干预6 d，0.6 mmol/L盐酸37℃脱钙24 h，吸取上清，钙定量检测试剂盒测定钙含量，脱钙后的细胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%的 SDS 溶解细胞 30 min，BCA 法［3］测定细胞蛋白含量，结果用细胞钙含量比蛋白含量表示(g/mg蛋白)。实验每组设3个复孔。

1.3.4 细胞核心结合因子 α1(Cbfα1)mRNA 及 I型胶原(ColⅠ)mRNA测定 细胞总RNA提取采用Trizol一步法。引物序列由Primer 5.0软件设计(Cbfα1:forward primer:5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3'，Reverse primer:5'-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3';CoIⅠ:forward primer:5'-GGTTTGGAGAGAGCATGACC-3'，Reverseprimer:5'-TTTGGGGAAAT-3'GAGTTTGG-3';GAPDH:forward primer:5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，Reverse primer:5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3')。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行检测。实验重复3次，以GAPDH作为内对照，计算Cbfα1 mRNA及ColⅠmRNA相对含量。

1.3.5 细胞及上清液ColⅠ蛋白的测定 提取细胞及上清液中总蛋白［5］，应用Western blot法进行检测。一抗采用兔抗ColⅠ抗体(1∶1000)或兔抗GAPDH抗体(1∶1000)，二抗为荧光标记的抗兔的抗体(1∶10000)，结果采用gel-Image J软件进行分析，实验重复3次，以GAPDH作为内对照，计算ColⅠ蛋白相对含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件，符合正态分布的计量资料用()表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，用S-N-K检验作多组间均数两两比较，相关分析符合双变量正态分布作Pearson积差相关分析，不符合双变量正态分布作Spearman秩相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs钙化测定 茜素红染色及von Kossa染色示:与健康血清组比较，尿毒症血清组VSMCs钙化染色均加重，随尿毒症血清浓度增高，钙化结节越明显。VSMCs钙沉积测定示:与健康血清组比较，尿毒症血清组钙含量均增高，5%浓度开始升高，15%浓度达最高，呈现浓度依赖性(P＜0.05)。见表1。

2.2 Cbfa1 mRNA表达 与健康血清组比较，尿毒症血清组Cbfα1 mRNA表达均升高(P＜0.05)。尿毒症血清组低、中、高三个亚组间两两比较，Cbfα1 mRNA表达差异均有统计学意义，趋势上5%浓度开始升高，15%浓度达最高，亦呈浓度依赖性(P＜0.05)。见图1，表2。

表1 不同血清刺激对血管VSMCs钙含量的影响(μg/mg 蛋白，)

表1 不同血清刺激对血管VSMCs钙含量的影响(μg/mg 蛋白，)

注:与健康血清组比较，﹟P＜0.05;与同组5%浓度比较，△P＜0.05;与同组10%浓度比较，▲P ＜0.05

组别 钙含量尿毒症血清组5%浓度 109.39 ±10.14﹟10%浓度 134.22 ± 4.90﹟△15%浓度 165.35 ±14.06﹟△▲健康血清组5%浓度 76.16 ± 2.3210%浓度 78.11 ± 2.3715%浓度76.55 ± 3.52

图1 不同浓度血清刺激后对VSMCs Cbfα1 mRNA表达的影响

表2 不同浓度血清刺激后对VSMCs Cbfα1 mRNA 表达的影响()

表2 不同浓度血清刺激后对VSMCs Cbfα1 mRNA 表达的影响()

注:与健康血清组比较，﹟P＜0.05;与同组5%浓度比较，△P＜0.05;与同组10%浓度比较，▲P ＜0.05

组别 Cbfα1 mRNA尿毒症血清组5%浓度 0.288 ±0.010﹟10%浓度 0.387 ±0.020﹟△15%浓度 0.427 ±0.020﹟△▲健康血清组5%浓度 0.223 ±0.02010%浓度 0.235 ±0.02015%浓度0.238 ±0.010

2.3 ColⅠmRNA及蛋白表达 与健康血清组比较，尿毒症血清组细胞ColⅠmRNA、细胞上清液中ColⅠ蛋白表达均升高，低、中、高三个亚组间呈现浓度依赖性，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。尿毒症血清组低、中、高三个亚组间比较结果见表3。同时检测发现健康血清组及尿毒症血清组细胞中均无ColⅠ蛋白表达。见图2、3。

图2 不同浓度血清刺激后对VSMCs ColⅠmRNA表达的影响

图3 不同浓度血清刺激后对VSMCs上清液中ColⅠ蛋白表达的影响

表3 不同浓度血清刺激对VSMCs ColⅠmRNA及上清液中ColⅠ蛋白表达的影响()

表3 不同浓度血清刺激对VSMCs ColⅠmRNA及上清液中ColⅠ蛋白表达的影响()

注:与健康血清组比较，﹟P＜0.05;与同组5%浓度比较，△P＜0.05;与同组10%浓度比较，▲P ＜0.05

组别 ColⅠ mRNA ColⅠ 蛋白尿毒症血清组5%浓度 0.682±0.010﹟ 0.651±0.02﹟10%浓度 0.719±0.030﹟△ 0.752±0.03﹟△15%浓度 0.910 ±0.020﹟△▲ 0.843 ±0.03﹟△▲健康血清组5%浓度 0.564 ±0.020 0.278 ±0.02010%浓度 0.595 ±0.040 0.399 ±0.04015%浓度0.598 ±0.040 0.509 ±0.080

2.4 尿毒症血清组VSMCs钙化、ColⅠ表达、Cbfα1表达的相关性 尿毒症血清组低、中、高三个亚组VSMCs钙含量与上清液中ColⅠ蛋白表达均呈正相关(r=0.797，P ＜0.01)，细胞 ColⅠ mRNA 表达与Cbfα1 mRNA 表达亦呈正相关 (r=0.784，P ＜0.05)。

3 讨论

CKD患者的血管钙化主要表现为中膜钙化，位于血管中膜的血管平滑肌细胞在CKD患者血管钙化中起着关键作用［6］。以前人们普遍认为CKD患者血管钙化是一种钙磷被动沉积于细胞和组织间的过程，而近年来证实，血管钙化是一个细胞介导的、主动的、高度可调的生物学过程，类似于骨和软骨的骨化过程，其钙化发生的中心环节是血管平滑肌细胞向成骨/成软骨样表型转化，然后启动的一系列异位成骨的过程［7］，最终导致包括血管在内的全身软组织发生矿化、钙化。本研究采用尿毒症血清模拟体内环境，对VSMCs进行刺激，分别用茜素红及von Kossa两种钙化染色方法证实尿毒症血清刺激可加重VSMCs钙化，使钙结节数目增加，具有典型细胞钙化的特征，与文献［8］报道一致，且尿毒症血清刺激可使钙含量升高。本研究发现，尿毒症血清可促进钙化发生、发展，且尿毒症血清浓度越高，钙化越严重，提示临床上CKD患者随时间延长CVD发生风险增高，可能与体内毒素水平升高诱导血管钙化有关。

成骨样细胞表型特征的钙化是血管钙化的结构基础，核心结合因子(Cbfα1/Runx2)作为成骨样细胞表型的标记物，是骨形成过程中的主要调节因子［9］，其是三个核心结合因子家族中的成员之一，另外两个成员为 Cbfα2、Cbfα3［10］。但 Cbfα1 不是成骨细胞所特有，其在发生钙化的血管平滑肌细胞中也表达［11］。本研究发现，尿毒症血清刺激VSMCs后细胞内Cbfα1 mRNA表达升高，呈现浓度依赖性，提示尿毒症患者血清干预VSMCs后诱导其发生表型转化，VSMCs成骨/成软骨样表型转化在血管钙化中可能发挥重要作用。

骨分子生物研究显示，骨基质形成的过程在某种程度上伴随ColⅠ累积的矿化发生过程［12］，ColⅠ作为细胞外基质的最主要组成成分，约占血管壁胶原成分的60%，属于“间隙胶原”，其成分改变对血管钙化的发生发展起重要作用。ColⅠ在骨矿化中的作用主要表现为:一是稳定细胞基质的作用;二是随细胞的ColⅠ量的积累，形成大量的类骨质，为矿化作准备，而ColⅠ在VSMCs中亦可能发生相似过程诱导钙化发生。研究证实VSMC由收缩型转化为合成型时，其对ColⅠ的合成能力大大加强，提示尿毒症血清可以诱导VSMCs表型转化进而分泌ColⅠ，从而使细胞保持一个稳定的状态，利于细胞外基质结构的形成，进一步发生矿化［13］。本研究采用尿毒症血清模拟体内环境，对VSMCs进行刺激，对细胞内及细胞上清液 ColⅠ分别进行检测，发现VSMCs内无ColⅠ蛋白表达，上清液可检测到ColⅠ蛋白表达，提示尿毒症血清刺激后VSMCs内ColⅠ蛋白含量升高，呈浓度依赖性，进一步证实ColⅠ属于分泌性蛋白。细胞钙含量变化与ColⅠ蛋白表达相关分析显示二者呈正相关，提示ColⅠ在诱导VSMCs钙化中发挥作用，与目前研究相一致［14］。本研究同时发现尿毒症患者血清刺激VSMCs后细胞内Cbfα1 mRNA及ColⅠ mRNA表达呈正相关，与目前关于Cbfα1可以正向调节成骨细胞特定ColⅠ蛋白基因的表达［15］的研究相一致。已知Cbfα1属于runt结构域基因家族，通过runt与DNA结合，可以调节成骨分化标志基因和成骨表型相关基因的表达，进一步促进骨分化和骨形成。

综上所述，不同浓度尿毒症患者血清刺激可使VSMCs发生钙化，其作用机制可能是通过VSMCs表型转化，促使ColⅠ蛋白表达升高。

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