亚临界水萃取陈皮中橙皮苷的工艺研究

齐 兵，何志勇，秦 肪，张连富，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

陈皮（Pericarpium Citri Reticulate）为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，是我国传统中草药之一[1]。橙皮苷（Hesperidin）为陈皮的有效活性成分，其纯品为白色针状晶体，分子式C28H34O15，相对分子量610[2]。研究表明，橙皮苷具有抗氧化[3]，抑菌消炎、抗病毒、抗癌[4-7]，预防心血管病症，维持血管正常渗透压、降低血管脆性、降血脂和防治动脉粥样硬化等生理功能，具有很高的药用价值[8-9]。目前，橙皮苷的提取方法主要是溶剂浸提和碱提酸沉，这些方法普遍存在得率低、耗时长以及提取物中易残留溶剂等问题。亚临界水又称高压热水、超加热水或热液态水，是指在一定的压力下，将水加热到100℃以上临界温度374℃以下的高温，水仍然保持在液体状态[10]。亚临界水萃取技术是近十几年来发展起来的一种新型绿色提取技术，采用价廉、无毒、无污染的水作为萃取剂，通过调节温度、压力使水的极性在较大范围内变化，可以选择性地提取不同极性的化合物，具有萃取效率高、时间短、环境友好等优点。本文研究了亚临界水萃取陈皮中橙皮苷的工艺条件，并与传统的乙醇热回流提取方法进行对比，为橙皮苷的短时高效，环境友好的工业化生产提供了理论依据，对于提高陈皮资源的综合利用率具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

陈皮条（3cm×0.5cm）购自毫州市永刚饮片厂有限公司；橙皮苷标准品 购自中国药品生物制品检定所，批号：110721-201014；乙醇、冰醋酸 分析纯；甲醇 色谱纯。

亚临界萃取设备（HL-SF-2L/20MPa/400℃-H2O）杭州华黎泵业；高效液相色谱仪（P3000A高压输液泵、UV3000型紫外检测器 北京创新通恒科技有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，R-205型旋转蒸发仪 上海申顺生物科技有限公司；ZK-072型真空干燥箱 上海市实验仪器厂；冰箱 无锡小天鹅股份有限公司；KJ-300超声波发生器 无锡市科洁超声电子设备有限公司；SHB-111A型循环水式多用处真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司；AB104-N型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱检测条件 Daiso-C18反相色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相[11]：甲醇∶6%醋酸=38∶62；pH=2.91；检测波长284nm；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样量20μL。

1.2.2 橙皮苷标准曲线的绘制 精确称取橙皮苷标准品10.3mg，用甲醇超声溶解，定容至50mL容量瓶中，制得浓度为0.206mg/mL的橙皮苷标准品储备液。精确吸取橙皮苷储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL用50%甲醇溶液定容至10mL容量瓶中。分别吸取上述溶液20μL进样，测定峰面积值，以峰面积值Y为纵坐标，橙皮苷浓度X为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 陈皮原料的筛选及处理 由于粉末易造成设备堵塞，因此本实验采用条状陈皮作为萃取原料。挑选出尺寸为（3～4）cm×（0.5～1）cm的陈皮条，于50℃的烘箱中干燥至恒重，然后放置于干燥器中保存备用。

1.2.4 橙皮苷提取得率 计算公式如下：

橙皮苷提取得率（%）=（提取得到橙皮苷质量/陈皮条质量）×100

1.2.5 亚临界水萃取实验 准确称取陈皮条原料50.0g放置于萃取釜中，密封好顶盖，设定蒸馏水流速为4L/h，开启压力泵后输入蒸馏水，直至充满整个萃取装置。在输水的过程中可设置预热釜温度到80℃。等到接收处有蒸馏水流出时，按照实验设计，分别设置预热釜温度、萃取釜上体及下体温度、蒸馏水流速以及萃取压力，当萃取釜内条件达到预设值后，开始计时提取，提取液经过急冷器与冷却釜降温后流出，用收集容器接收提取液。亚临界水萃取装置的结构示意图如图1所示。

图1 2L亚临界水萃取装置示意图Fig.1 Schematic diagram of 2L subcritical water extraction apparatus

将收集到的提取液在60℃下真空旋转蒸发至原体积的1/10，将浓缩液放置于4℃冰箱冷却过夜至沉淀完全，减压过滤，收集沉淀，65℃下真空干燥至恒重。采用HPLC法检测粉末中橙皮苷的含量，并按照1.2.4的方法计算橙皮苷的提取得率。以橙皮苷的提取得率为指标，分别考察萃取温度、压力、蒸馏水流速及萃取时间对亚临界水萃取效果的影响。

1.2.6 乙醇热回流提取实验 应用前期研究得到的最佳工艺条件[12]：乙醇浓度75%、温度85℃、料液比1∶35（g∶mL）、提取时间150min，进行乙醇热回流提取，并与亚临界水萃取的效果进行对比。

2 结果与讨论

2.1 萃取温度对橙皮苷提取得率的影响

在萃取压力为6MPa，蒸馏水流速40mL/min，提取时间120min的条件下，分别设定萃取温度为100、120、140、160、180℃，考察温度对橙皮苷提取得率的影响，结果如图2所示。

图2 温度对橙皮苷提取得率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of hesperidin

从图2中可以看出，温度低于140℃时，随着温度的升高橙皮苷的提取得率增加，这是由于升高温度，水的极性、表面张力和粘度都急剧下降[13]，其性质更加接近于有机溶剂，使室温下难溶于水的橙皮苷溶解度增加。但是当温度超过140℃后，继续提高温度橙皮苷的提取得率反而下降，一方面是由于温度升高后陈皮中的纤维素、半纤维素、果胶[14]等物质在亚临界水中的溶解也会增加，阻碍了橙皮苷的溶解；另一方面受到橙皮苷热稳定性的限制，温度过高还会造成橙皮苷的分解。因此，选择亚临界水萃取橙皮苷的最佳温度为140℃。

2.2 萃取压力对橙皮苷提取得率的影响

在萃取温度140℃，蒸馏水流速40mL/min，提取时间120min的条件下，分别调节萃取压力为6、9、12、15MPa，考察萃取压力对橙皮苷提取得率的影响，结果如图3所示。

图3 压力对橙皮苷提取得率的影响Fig.3 Effect of pressure on extraction rate of hesperidin

从图3中可以看出，在保持温度与蒸馏水流速不变的情况下，压力增加对于橙皮苷的萃取得率影响不大。这是主要是由于压力的变化对于水的介电常数和溶解能力影响比较小，有文献报道称[15]亚临界水萃取的压力从0.1MPa增加到10MPa时，水的介电常数仅仅增加了0.37，所以亚临界水萃取压力的选取只需要能够使水维持在液体状态即可。6MPa足够维持水在100～200℃处于液体状态，因此选择亚临界水萃取橙皮苷的最适压力为6MPa。

2.3 蒸馏水流速与萃取时间对橙皮苷提取得率的影响

设置萃取温度为140℃，压力为6MPa，分别在蒸馏水流速为20、40、60mL/min的条件下提取，从0min开始每隔20min收集并检测提取得到橙皮苷的含量。考察蒸馏水流速与提取时间对橙皮苷得率的影响，结果如图4所示。

图4 流速与萃取时间对橙皮苷提取得率的影响Fig.4 Effect of flow rate and time on the extraction rate of hesperidin

从图4中可以看出，在相同的提取时间内，流速增大，橙皮苷的提取得率也相对提高。蒸馏水流速为40mL/min与60mL/min时的提取得率明显高于20mL/min。这是由于水在流动的状态下，一方面可以与固体物料之间发生搅动、碰撞、摩擦等作用；另一方面，能够在固液相主体之间快速形成新的浓度梯度，因而增加流速能够加速橙皮苷向水溶剂中的扩散运动。但当蒸馏水的流速由40mL/min增加到60mL/min时，橙皮苷的最大提取得率差别不大。但蒸馏水流速的增加会导致最终提取液体积的增加，给后续的提取液浓缩处理所工作造成困难。同时，提高流速也会增加压力泵的负担。综合考虑以上因素，选择40mL/min为最佳流速。

从图4中还可以看出，在蒸馏水流速为40mL/min的条件下，当提取时间达到100min时，橙皮苷的提取得率基本不再增加，因此，提取时间选择为100min。此时蒸馏水总流量为4000mL，其料液比为1∶80（g∶mL）（陈皮质量/蒸馏水体积）。

2.4 亚临界水萃取验证实验

准确称取50.0g陈皮条装入萃取釜，在温度为140℃，压力6MPa，蒸馏水流速为40mL/min的条件下，提取100min，重复三次，进行验证性实验，结果见表1。

实验结果表明，优选得到的亚临界水萃取条件重复性好，稳定可行，因此最佳工艺条件有效可行。

表1 亚临界水萃取验证实验Table 1 Verificafion test of subcritical water extraction

2.5 两种提取方法的对比结果

表2为乙醇热回流与优化得到的亚临界水萃取橙皮苷的最佳提取工艺的提取条件与提取得率的对比结果。

表2 两种提取方法对比结果Table 2 Contrast results of the two methods

从对比结果可以看出，亚临界水萃取法相对于传统的乙醇热回流法提取得率高，萃取时间短，并且无需消耗有机溶剂，绿色环保，具备明显的竞争优势。

3 结论

研究得到亚临界水萃取陈皮中橙皮苷的最佳提取条件为：萃取温度140℃，压力6MPa，流速40mL/min，提取时间100min，橙皮苷的提取得率为3.53%±0.05%。亚临界水萃取法采用廉价、环保的水作为萃取溶剂，与传统的乙醇热回流提取法相比，具有提取时间短、得率高、无溶剂残留等优势。本研究将亚临界水萃取技术应用于陈皮中橙皮苷的提取，是一种新探索，为亚临界水萃取技术在植物提取领域的研究提供理论基础，对于实现天然产物的绿色、高效工业化生产具有重要意义。

[1]梁支柱，唐卫东.对陈皮不同炮制品中黄酮类成分变化的研究[J].亚太传统医药，2010，5（6）：34-35.

[2]Garg A，Gatg S，Zaneveld L J D，et al.Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin[J].Phytotherapy Research，2001，15（8）：655-669.

[3]Balakrishnan A，Menon V P.Antioxidant properties of hesperidin in nicotine-induced lung toxicity[J].Fundamental&Clinical Pharmacology，2007，21（5）：535-546.

[4]Mu ZY，Takana T，Yoshinobu H，et al.Chemopreventive effects of diosmin and hespefidin on N-butyl-N-（4-hydroxybutyl）nitrosamine-induced urinary-bladder carcinogenesis in male ICR mice[J].International Journal of Cancer，1997，73（5）：719-724.

[5]Park H J，Kim M J，Ha E，et al.Apoptotic effect of hesperidin through caspase3 activation in human colon cancer cells，SNUC4[J].Phytomedicine，2008，15（1）：147-151.

[6]Teresita G，Alejandra E R，Americo O J，et al.Antiinflammatory properties of plant flavonoids effects of rutin，quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat[J].Farmaco，2001，56（9）：683-687.

[7]Kim D H，Song M J，Bae E A，et al.Inhibitory effects of herbalmedicineson rotavirusinfectivity[J].Biologicaland Pharmaceutical，2000，23：356-360.

[8]Yamamoto M，Suzuki A，Hase T.Short-term effects of glucosyl hesperidin and hesperetin on blood pressure and vascular endothelial function in spontaneously hypertensive rats[J].Journal of nutritional science and Vitaminology，2008，54（1）：95-98.

[9]Ohtsuki K，Abe A，Mitsuzumi H，et al.Glucosyl hesperidin improves serum cholesterol composition and inhibits hypertrophy in vasculature[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2003，49（6）：447-450.

[10]何健，夏凡.亚临界水萃取技术在食品工业中的应用[J].江西食品工业，2010（1）：45-47.

[11]袁金斌，周志炎.HPLC测定陈皮提取物及制剂中橙皮苷的含量[J].中成药，2006，28（3）：455-456.

[12]齐兵，何志勇，秦肪，等.陈皮中橙皮苷的提取与纯化工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（24）：343-346.

[13]Shalmashi A，Abedi M，Golmohammad F，et al.Isolation of caffeine from tea waste using subcritical water extraction[J].Journal of Food Process Engineering，2010，33（4）：701-711.

[14]Masahiro Tanaka，Arata Takamizu，Munehiro Hoshino，et al.Extraction of dietary fiber from Citrus junos peel with subcritical water[J].Food and Bioproducts Processing，2012，90（2）：180-186.

[15]吴仁铭.亚临界水萃取在分析化学中的应用[J].化学进展，2002，14（1）：32-36.