以活性为指导分离珊瑚藓净抗菌有效成分及作用机理初步研究

李思明，沙长青，杨 非

(1.黑龙江省科学院微生物研究所应用医学微生物室，哈尔滨 150010;2.黑龙江省科学院，哈尔滨 150001;3.哈尔滨市中心医院检验科，哈尔滨 150087)

真菌是医院内感染常见微生物，由真菌引起的感染临床诊断率较低、病情进展迅速且变化快，因此死亡率高，其中念珠菌感染病死率高达55%～70%。真菌感染按感染部位可主要分为表浅真菌感染和深部真菌感染两大类。表浅部真菌只侵犯表浅角化组织(如皮肤，毛发、指甲等)，引起身体如头、手足、体、股等癣症，发病率高。深部真菌感染主要侵犯内脏、骨骼和中枢神经系统，并以白色念珠菌的继发感染比较多见，致死率高，危害性较大［1-2］。现市面上所售药物大多为西药，如两性霉素B、萘替芬、氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬等，这些药物对于浅表部真菌感染难以完全治愈，容易复发，具有一定的毒副作用。而且近年来由于广谱抗生素大量使用，以及一些免疫抑制剂的广泛应用使耐药株增多，真菌感染病日趋严重，因此寻找广谱、高效、毒副作用小的抗真菌新药具有十分重要的意义［3-4］。

中药是中华民族的瑰宝，我国劳动人民几千年智慧的结晶。中药复方包括古代流传下来的有确切疗效的传统方剂，也包括现代临床使用的疗效明确的一些新复方。几千年来所积累的方剂数量多达数十万，明代的《普济方》所收载的方剂达61 739首，近年来我国科研人员对流传下来的方剂更是费尽心血整理研究，仅1997年出版的《中医方剂大辞典》中选收的方剂就达96 592首。各少数民族也积累了大量的药方，常见的如藏药有400多种，蒙药500多种，维药310种，壮药70多种，彝药324种，白药151种，苗药163种，等等。中药是我国的传统优势资源，其价格低廉、效果确实。因此，寻找能够治疗浅表皮真菌感染的中药并对其进行深入研究，寻找其活性部位或者单体，探明其物质基础，提高药物疗效有着十分重要的意义和广阔的市场前景。近年来，中药现代化的研究遇到了一些难题和理论上的瓶颈，中药往往由很多味中药组成，包含的化学成分有成千上万，有些复方往往由很多种化学成分共同作用，因此，中药作用的化学成分和作用机理很难阐述清楚，对药物的质量控制也造成了一定困难。而在国际上，上市药物必须确定作用成分和作用机理，这就对中药进一步研究、走向世界造成了很大的困难。一部分科研工作者试图完全用西医的理论体系来研究并寻找中药中起作用的化学单体，但往往发现中药化学成分是一个整体作用，在经过成分拆分后往往分开几部分都没有作用，这就要求我们要以创新的方法进行研究，尽快攻克中药现代化中存在的难题［5-6］。

珊瑚藓净是一种治疗足癣的民间药，经临床证明对足癣有很好的疗效，目前还没有对其有效成分和药理学的相关研究。足癣病多由浅部或者深部真菌感染而生。引起足癣的真菌很多，主要有白色念珠菌、红色毛藓菌、须子样毛藓菌(石膏样毛癣菌)等［7-9］。本研究拟以抗菌活性为指导分离珊瑚藓净的活性成分并初步研究珊瑚藓净的药理作用。试验采用琼脂扩散法、微量稀释法对珊瑚藓净药敏活性进行测定［10］，并以珊瑚藓净抗白色念珠菌活性为指导，对珊瑚藓净进行分离纯化，寻找其抗菌活性成分，探明其作用的物质基础。通过扫描电镜观察给药前后白色念珠菌外部形态的变化，初步了解其对白色念珠菌作用机理。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

红色毛藓菌(T.rubrum)ATCC294;

石膏样毛藓菌(Richophytion mentagrophytes)LZY8905;

白色念珠菌(Canidia Albicans)ATCC10231。

(以上菌种由中科院微生物保藏中心提供)。

1.2 试剂

正己烷、氯仿(分析纯，北京化工厂);

SH1珊瑚藓净水煎剂提取物(自制);

L1两性霉素B(sigma公司)。

1.3 仪器

高效液相色谱仪:Aglient 1200，Aglient Shimadzu LC-20高效液相色谱仪，

Waters HPLC2695-2487;

核磁共振仪:Bruker Avance 500MHz，Bruker AvanceⅢ400MHz，TMS 为内标，

2 D-NMR标准软件—XWIN-NMR，version 2.6 software;

旋转蒸发仪:RE-52A型，上海亚荣科技有限公司;

酶标以仪:TECNAⅡ-SAFIRE2酶标仪，瑞士TECAN集团公司;

真空冻干机:FD-1E-80，深圳三利试验仪器公司;

扫描电镜:日立S-3400N扫描电镜。

1.4 培养基

LB培养基:胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，纯净水补齐1 000mL，121℃高压20min。

土豆培养基:马铃薯200g沸水煮5min左右，葡萄糖20g，琼脂16g，纯净水补齐1 000mL，121℃高压灭菌20min。

沙氏培养基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂粉18g(固体)，纯净水补齐1 000mL，121℃高压灭菌20min。

2 试验方法

2.1 珊瑚藓净有效成分的初步分离

将珊瑚藓净用8～10倍体积用氯仿反复提取，合并提取浓缩得浸膏4.729g，将所得样品用硅胶柱层析，洗脱液为正己烷—氯仿的梯度混合溶液 (体积比10∶0～4∶6)，结合薄层层析检测结果，合并相似成分。将得到组分用旋转蒸发仪浓缩成浸膏并称量。

2.2 微量稀释法测定珊瑚藓净抗菌活性

将硅胶柱色谱分离得到的 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四个组分用真空冻干机冻干至粉状蒸干，并用沙氏培养基溶解至浓度为1 280μg/mL.并在96孔聚苯乙烯板中倍比稀释，并分别接种白色念珠菌、红色毛癣菌、须子样毛癣菌悬液，使每孔终体积为100μL，48h后用肉眼直接观察结果，小孔内完全抑制细菌生长的最小浓度为MIC值。

2.3 高效液相色谱(HPLC)分离Fra2主要成分

将fra2在真空冻干机冻干，用80% 甲醇溶解。溶液进行离心(12 000r/min，15min)，取上清，用HPLC分离并收集其中主要组分。

2.4 微量稀释法测定Z1、Z2、Z3三种化合物抗白色念珠菌活性

将得到的化合物用微量稀释法测定对白色念珠菌的抑菌效果(试验方法同2.2)。

2.5 核磁共振仪鉴定化合物Z2结构

用核磁共振仪检测单体化合物Z2(溶剂DMSO)，通过氢谱(1H-NMR)，碳谱(13C-NMR)，DEPC-NMR，HSQC-NMR，HMBC-NMR分析Z2的化学结构。

2.6 扫描电镜观察Z2对白色念珠菌细胞膜形态影响［11-14］

药物在细胞膜内与脂醇(Ergosterol)结合而造成细胞膜通透性的改变，导致真菌细胞内的成分，钾离子及其他成分如氨基酸、蛋白质等泄漏到膜外，破坏真菌正常代谢及抑制生长，细胞产生裂解而造成细胞死亡［11-13］。因此，拟采用本试验观察珊瑚藓净对白色念珠菌细胞膜的影响。将Z2在灭菌后的24孔聚苯乙烯板中倍比稀释，并接种白色念珠菌菌悬液使每孔终体积为200μL，将载玻片放入24孔板所示各孔孵育48h后取出并在电镜下观察结果［14-16］。

3 试验结果

3.1 珊瑚藓净有效成分的初步分离结果

将珊瑚藓净氯仿提取物用正己烷-氯仿体系进行梯度分离，得到Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四个流分，重量分别为 0.35g、1.23g、0.58g、0.89g。

3.2 微量稀释法测定 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4 四种组分抗真菌药敏试验结果

试验结果表明，Fra1、Fra2、Fra3、Fra4对红色毛藓菌、石膏样毛藓菌均无明显抗菌效果。而Fra2对白色念珠菌有明显抑制效果，最小抑菌浓度(MIC)达到40ug/mL(见表1)，而珊瑚藓净氯仿粗提物最小抑菌浓度(MIC)为640ug/mL，因此Fra2为珊瑚藓净的活性成分。

表1 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4抗白色念珠菌MIC值 (单位μg/mL)Tab.1 Fra1，Fra2，Fra3，Fra4 anti-candida MIC result

图1 Fra2 HPLC结果Fig.1 Fra2 HPLCresult

3.3 高效液相色谱(HPLC)分离Fra2主要成分结果

由图1可知，高效液相色谱在Fra2中共分离到三种主要化合物(图中标示为1、2、3)，收集化合物，记做 Z1、Z2、Z3，称重得到重量分别为 85mg，121mg，32mg。

3.4 微量稀释法测定Z1、Z2、Z3三种化合物抗白色念珠菌药敏试验结果

由表2可知，化合物Z2的最小抑菌浓度(MIC)为10μg/mL，Z1、Z2均没有明显的抑菌效果，因此 Z2是 Fra2中的主要抑菌成分。

表2 Z1，Z2，Z3抗白色念珠菌MIC值 (单位μg/mL)Tab.2 Z1，Z2，Z3 anti-candida MIC result

3.5 核磁共振法(NMR)鉴定化合物Z2结构

经过NMR图谱结果分析，Z2结构为:

命名为 1，3，4，6-4 氨基己烷(1，3，4，6-4 amino hexane)

图2 化合物Z2的1 H-NMR图谱(DMSO-d6)Fig.2 Z2 1 H-NMR Spectra(DMSO-d6)

图3 化合物Z2的13 C-NMR图谱(DMSO-d6)Fig.3 Z213 C-NMR Spectra(DMSO-d6)

图4 化合物Z2的DEPT-NMR图谱(DMSO-d6)Fig.4 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

3.6 扫面电镜观察Fra2对白色念珠菌细胞膜的影响结果

在药物浓度为320μg/mL时(图7)，白色念珠菌基本死亡，电镜下几乎看不到白色念珠菌细胞，只能看到少量没有生长到一定体积细胞就发生破裂的白色念珠菌细胞。能看到少量散落的菌丝，细胞壁有明显的褶皱。在药物浓度为80μg/mL(图8)时，在电镜下能观察到已经破裂的白色念珠菌细胞和菌丝体，细胞壁有明显褶皱，与阳性对照两性霉素B药物浓度10μg/mL(图12)下观察到的结果相似。在药物浓度为10μg/mL时(图9)，在电镜下未能观察到已经破裂的白色念珠菌细胞，正常存活的细胞细胞壁有明显褶皱。在药物浓度为5μg/m(图10)时，在电镜下未观察到破裂的白色念珠菌细胞，正常存活的细胞细胞壁未出现褶皱，菌体表面光滑，生长状态正常，与阴性对照(图11)观察到的结果相似。从扫描电镜结果可以看出，珊瑚藓净有效部位Fra2对白色念珠菌有明显的抑制效果并呈现出对药物的剂量依赖效应。

图5 化合物Z2的HSQC-NMR图谱(DMSO-d6)Fig.5 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

图6 化合物Z2的HMBC-NMR图谱(DMSO-d6)Fig.6 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

图7 白色念珠菌扫描电镜图(药物浓度为320μg/mL)Fig.7 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level320μg/mL)

图8 白色念珠菌扫描电镜图(药物浓度为80μg/mL)Fig.8 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level 80μg/mL)

图9 白色念珠菌扫描电镜图(药物浓度为10μg/mL)Fig.9 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level10μg/mL)

图10 白色念珠菌扫描电镜图(药物浓度为5μg/mL)Fig.10 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level 5μg/mL)

图11 白色念珠菌扫描电镜图(阴性对照)Fig.11 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(negative control)

图12 白色念珠菌扫描电镜图(两性霉素B 10μg/mL)Fig.12 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(amphotericin B10μg/mL)

4 讨论

珊瑚藓净是一种有效的抗真菌中成药，将其用氯仿提取所得样品再通过硅胶柱层析得到有效组分Fra2，经微量稀释法测定，Fra2对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)值为40μg/mL，有明显的抑菌效果。用HPLC对Fra2进行纯化得到三种主要化合物Z1、Z2、Z3，经药敏试验测定Z2最小抑菌浓度(MIC)值为10μg/mL，与珊瑚藓净水提剂SH1相比最小抑菌浓度提高了64倍，使药物的作用效果显著提高，为珊瑚藓净的有效作用成分。经过NMR鉴定Z2的化学成分为1，3，4，6-4氨基己烷。通过显微镜、扫描电镜观察发现，从珊瑚藓净中得到的单体化合物Z2可以破坏白色念珠菌的细胞膜并使白色念珠菌细胞裂解死亡。研究表明，化合物Z2是以活性为指导从珊瑚藓净中得到的抗白色念珠菌有效单体，是一种潜在的抗真菌新药。因此，对Z2进行进一步研究，开发治疗足癣的新药，有着十分重要的意义和广阔的市场前景。

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