通天草提取物对AD大鼠行为学的影响

2013-09-03贾博宇李宝龙周忠光

黑龙江科学 2013年1期

贾博宇，姜波，李宝龙，刘旭，周忠光

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

随着人类寿命的延长，与年龄相关性疾病的发病率也显著增加，而以脑疾病增加最为显著［1］，其中最典型的代表疾病即为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，即人们常说的“老年性痴呆”。AD是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的神经退行性疾病。临床上表现为学习记忆能力下降、分析判断能力减退、情绪改变及行为失常，严重者可出现意识模糊。目前对这类疾病的治疗仍具挑战性，使患者及其家人感到恐慌，AD不仅严重影响老年人的日常生活和社会活动能力，还常常剥夺人类的精神活动功能，其病情随时间呈进行性加重，在几年内便可丧失独立生活能力。老年痴呆已经成为现代社会的一个危机，被人们形象地称为“时间炸弹”。

通天草又名地栗梗，《饮片新参》中称之为荸荠梗，在《苏州本产药材》中称为荸荠苗，还有一种叫法为野荸荠苗。为莎草科(Cyperaceae)植物荸荠 Heleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.ex Henschel的地上茎部分。本品性味苦、平，有化湿热，利小便，通淋的作用，主要用来治疗“呃逆”和“小便不利”等症。本课题组经研究发现通天草提取物对老年性痴呆具有一定的防治作用。本研究采用醇提法和水提法，分别从通天草里提取相关可溶性物质，分组给药一段时间后，观察AD大鼠模型Morris水迷宫行为学的影响，从而为开发治疗阿尔茨海默症的新药提供新的数据支持和理论基础。

1 通天草提取物的制备

本研究所用通天草提取物，均在黑龙江中医药大学药物安全性评价中心试验室利用“醇提法”和“水提法”自行提取得到。

1.1 试验药材来源及鉴定

1.1.1 试验药材来源

通天草:为莎草科(Cyperaceae)植物荸荠Heleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.ex Henschel的干燥地上茎部分。产地江苏。

1.1.2 鉴定依据及结果

试验所用全部药材均购自于哈尔滨市药材公司，按照1989年江苏地方标准有关通天草的各项规定检查，鉴定结果均符合规定。

1.2 试验仪器设备

RE-52系列旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司);101-0AB型电热恒温鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);FA2004型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司);HY-02型粉碎机(北京环亚天元机械技术有限公司);KQ-160TDB型高频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DETW型调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);SHZ-IIIB型循环水真空泵(沈阳海普瑞真空设备有限公司)。

1.3 试验试剂

无水乙醇(分析纯，天津天力化学试剂厂)

1.4 提取方法

1.4.1 醇提取物

精密称取通天草400g，加10倍量(4 000mL)的80%乙醇浸泡1.5h至饱和，加热回流提取2次，每次回流1.5h，过滤，残渣晾干待用，合并两次滤液，分批装入旋转蒸发仪40℃ ～50℃减压回收，乙醇待用，合并残留药液水浴90℃蒸干后放入干燥箱，60℃干燥得到醇提取物质干膏，打粉待用。

1.4.2 水提取物

上一过程中过滤得到的药材残渣，加10倍量(4 000mL)的蒸馏水加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并两次滤液，加热浓缩至500mL，水浴90℃蒸干，放入干燥箱60℃干燥得到水提取物质干膏，打粉待用。

1.5 出膏率测定

试验共计提取通天草原药材7 013.1g。醇提法:得干膏417g，1g药粉含原药材 17.1469g;水提法:得干膏451.2g，1g 药粉含原药材 15.6229g。

2 通天草提取物对AD大鼠行为学影响的试验研究

2.1 试验动物

选择4～5月龄清洁级Wistar雄性大鼠，体重220g±20g，由黑龙江中医药大学试验动物中心提供，动物许可证号:SCXK黑2008004。

2.2 试验仪器设备

Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所);SN-2大鼠脑立体定位仪(日本);10ul微量进样器(宁波市镇海玻璃仪器厂);52-97型自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

2.3 试验试剂及药品

Aβ1-40(Sigma公司);水合氯醛(昆山);0.9%生理盐水(哈药集团制药六厂);吡拉西坦片(又名脑复康片，东北制药厂生产，国药准字H21021775，产品批号101250;配制成含生药0.0432g/mL水溶液，4℃保存);通天草提取物(醇低组 0.04724g/mL;醇高组 0.189g/mL;水低组(0.05185g/mL;水高组 0.2074g/mL)。

2.4 试验过程

2.4.1 动物筛选

大鼠在屏障系统内饲养观察7d后，进行Morris水迷宫测试，筛选智力正常(潜伏期≤60S)并且游泳姿势正常的Wistar大鼠用于本次试验。

2.4.2 动物分组

随机选取96只经水迷宫筛选合格大鼠，随机分为空白组、假手术组、模型组、醇提低剂量组、醇提高剂量组、水提低剂量组、水提高剂量组和西药对照组，每组各12只。

2.4.3 模型复制

用0.9%无菌生理盐水将Aβ1-40稀释成浓度为5g/L的溶液，将稀释液放置于37℃恒温箱中7d，使Aβ1-40形成聚集肽，然后取出放入-20℃冰箱中备用。

手术器械及手术台先用紫外线照射再用75%酒精和碘伏消毒，大鼠造模前24h禁食，腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉。将大鼠的头部水平固定于脑立体定位仪上，去除手术区毛发并做常规消毒，然后沿矢状线切开皮肤，切口长约2cm，向两侧推开皮肤和骨膜，找到“前囟”位置［2，3］。并经预试验确定颅骨上能够到达大鼠海马Ca1区位置的注射点及进针深度(前囟后3.5mm，中线向左旁开2mm，进针3.5mm)，用9号钢针自制的钻头在注射点打孔，微量注射器自颅骨硬模下垂直进针3.5mm，然后在5min内向脑组织内缓慢匀速注射 Aβ1-40溶液2uL(10μg)，注射完成后留针5min，然后缓慢退针，用牙科泥封住颅骨孔，手术区撒少量青霉素消炎，缝合皮肤并用碘伏消毒，假手术组用等体积0.9%生理盐水代替Aβ1-40溶液，空白组不作任何处理，手术后大鼠单笼饲养至完全清醒。

2.4.4 给药剂量及疗程

各组大鼠造模完成后第7d开始，每日灌胃给药1次:醇提高剂量组(1.89g/kg·d)，醇提低剂量组(0.47g/kg·d)，水提高剂量组(2.07g/kg·d)，水提低剂量组(0.52g/kg·d)，西药组(0.43g/kg·d)，空白组、假手术组与模型组大鼠每日给予等容积0.9%无菌生理盐水，各组疗程都是28d。

2.4.5 行为学检测

各组大鼠在造模后的第2d和给药后第24d分别进行Morris水迷宫测试，测试方法同2.4.1，记录大鼠潜伏期和60s内穿过原平台位置的次数。

2.4.6 统计学分析

试验数据组间比较使用SPSS16.0进行t检验，结果以±S表示。

3 试验结果

造模后的各组AD大鼠在前4d的定位航行试验中，游泳轨迹多表现为边缘型或随机型，空白组和假手术组部分大鼠在试验的2～4d内能够凭借空间记忆找到平台，第5d的空间搜索试验，各组AD大鼠的空间记忆能力明显较空白组和假手术组大鼠差，入水后仍表现为随机型，而空白组和假手术组大鼠多表现出直线型。各给药组大鼠经过28d治疗后，其学习记忆能力都有不同程度的改善，而模型组游泳轨迹仍表现出边缘型和随机型。

3.1 不同时期各组大鼠潜伏期的变化

造模前各组大鼠都经过Morris水迷宫筛选，其潜伏期无差别，术后第6d所做空间搜索试验(结果见表1、图1)，模型组大鼠潜伏期与正常组大鼠相比差异有显著性意义(P＜0.01)，而假手术组大鼠潜伏期与正常组大鼠相比差异无意义(P＞0.05)，说明模型复制成功且稳定性良好。其余5个给药组大鼠潜伏期与正常组大鼠比较，时间明显延长，差异有显著性意义(P＜0.01)，说明大鼠产生了认知功能障碍，可用于本试验。

给药治疗后第28d，空间搜索试验(结果见表1、图1)显示，模型组、醇提低剂量组、水提高剂量组和水提低剂量组与空白组比较具有显著差异(P＜0.01)，潜伏期时间相对延长;醇提高剂量组、醇提低剂量组、水提高剂量组和西药组与模型组比较具有显著差异(P＜0.01)，潜伏期时间明显缩短;水提低剂量组与模型组比较具有差异(P＜0.05)，潜伏期时间有所缩短，说明各组大鼠经过治疗后，认知功能有所提高。

表1 治疗前后各组大鼠Morris水迷宫试验潜伏期的变化(±S)Tab.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze(±S)

注:与空白组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

组别例数剂量(g/kg) 造模后(s) 治疗后(s)空白组 12 等体积 25.08±4.64 23.08±6.59ΔΔ假手术组 12 等体积 24.33±5.60 23.42±4.62ΔΔ模型组 12 等体积 44.75±6.51＊＊ 44.67±7.80＊＊醇提高剂量组 12 1.89 44.17 ±8.90＊＊ 25.92 ±8.36ΔΔ醇提低剂量组 12 0.47 46.75 ±5.12＊＊ 34.75 ±10.31＊＊ΔΔ水提高剂量组 12 2.07 47.08 ±7.82＊＊ 32.25 ±7.46＊＊ΔΔ水提低剂量组 12 0.52 44.33 ±8.66＊＊ 38.08 ±8.35＊＊Δ西药组 12 0.43 45.00±6.24＊＊ 25.25±6.21ΔΔ

3.2 不同时期各组大鼠穿越平台的次数

造模后第6d所做空间搜索试验(结果见表2、图2)，模型组、西药组和通天草提取物4个给药组与正常组比较，穿越平台次数明显减少，差异有显著性意义(P＜0.01);而且假手术组大鼠与正常组大鼠比较差异无意义(P＞0.05)，证明模型复制成功且稳定性良好。

图1 治疗前后各组大鼠Morris水迷宫实验潜伏期的变化Fig.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze

给药后第28d，空间搜索试验(结果见表2、图2)显示，模型组与空白组比较有显著差异(P＜0.01)，说明模型稳定;通天草提取物4个给药组和西药组与空白组比较无差异(P＞0.05);醇提高剂量组和西药组与模型组比较具有显著差异(P＜0.01)，穿越平台次数明显增加;醇提低剂量组、水提高剂量组与模型组比较具有差异(P＜0.05)，穿越平台次数有所增加;水提低剂量组与模型组比较无差异(P＞0.05)，但穿越平台次数也相对有所增加;说明各组大鼠治疗后认知功能有所提高。

表2 治疗前后各组大鼠穿越平台的次数(x±S)Tab.2 The number of rats in each group through the platform before and after treatment(x±S)

4 讨论

Morris水迷宫是英国心理学家Morris于1981年设计并应用于检测大鼠空间学习记忆能力的一种常用装置，已经成为一种研究空间学习和记忆能力的标准模式，被广泛应用于与啮齿类动物视觉相关的空间记忆和工作记忆的测量中。

通过对比不同时期各组大鼠潜伏期和穿越平台的次数，可知造模后模型组和5个给药组的大鼠潜伏期和穿越平台的次数与正常组大鼠比较，时间明显延长，次数明显减少，差异有显著性意义(P＜0.01)，说明试验所需AD大鼠模型复制成功。治疗后水迷宫试验结果显示，醇提低剂量组、水提高剂量组和水提低剂量组与空白组比较具有显著差异(P＜0.01)，潜伏期时间相对延长;醇提高剂量组、醇提低剂量组、水提高剂量组和西药组与模型组比较具有显著差异(P＜0.01)，潜伏期时间明显缩短;水提低剂量组与模型组比较具有差异(P＜0.05)，潜伏期时间有所缩短;说明醇提高剂量组、醇提低剂量组、水提高剂量组、水提低剂量组和西药组对提高AD大鼠认知功能都具有一定效果，其中醇提高剂量组和西药组作用效果最强，水提低剂量组疗效最差。醇提高剂量组、醇提低剂量组、水提高剂量组、水提低剂量组和西药组与空白组穿越平台次数比较无差异(P＞0.05);醇提高剂量组和西药组与模型组比较具有显著差异(P＜0.01)，穿越平台次数明显增加，证实醇提高剂量组和西药组疗效最好，比较其潜伏期和穿越平台次数，发现醇提高剂量组治疗后潜伏期为25.92±8.36，穿越平台次数为3.17±1.59，西药组治疗后潜伏期为25.25±6.21，穿越平台次数为 3.25 ±1.49，说明西药组的疗效略好于醇提高剂量组;醇提低剂量组、水提高剂量组与模型组比较具有差异(P＜0.05)，水提低剂量组与模型组比较无差异(P＞0.05)，但穿越平台次数都有所增加，说明这三组药物也具有一定的治疗效果，比较其潜伏期和穿越平台次数，发现水提高剂量组治疗后潜伏期为32.25±7.46，穿越平台次数为2.92±1.38，醇提低剂量组治疗后潜伏期为 34.75 ±10.31，穿越平台次数为 2.83 ±1.40，水提低剂量组治疗后潜伏期为38.08±8.35，穿越平台次数为2.58±1.17，因此推测这三组通天草提取物的药效:水提高剂量组＞醇提低剂量组＞水提低剂量。