高蛋白酶解及抗营养因子降解菌株的筛选

东北农业大学生命科学学院 王婧瑶 刘 威 曹蕾蕾 叶忠雪 王立群＊

黑龙江华森畜牧科技有限公司 张刘运 张日阔

豆粕作为一种质量稳定的植物蛋白源，因其供应充足，氨基酸组成合理，含有异黄酮、脂肪酸、矿物质等生物活性物质及营养成分，日渐受到人们的青睐（余龙江等，2003）。然而，豆粕却有其自身的局限性。一方面，豆粕主要是由大分子蛋白构成，不能像小分子蛋白——寡肽和游离氨基酸被机体充分吸收。另一方面，豆粕中含有大量抗营养因子，特别是其中的胰蛋白酶抑制因子和植酸含量较较高，均可达到2%左右，这不仅降低动物机体对营养物质的利用，也其影响健康（游金明等，2006；石慧，2006）。本研究即以蛋白酶活力、酸溶蛋白、游离氨基酸以及胰蛋白酶抑制因子和植酸含量为指标，采用紫外线诱变的方法，通过发酵豆粕筛选出可提高其中小分子蛋白含量且降低抗营养因子作用的优良菌株，使得发酵后的豆粕更有利于动物的消化和吸收，从而提高其经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 菌株JY，由东北农业大学微生物实验室保存。

1.1.2 培养基 脱脂奶粉琼脂培养基：脱脂奶粉40 g、琼脂20 g、水1000 mL。奶粉和琼脂分开灭菌，121℃下灭菌15 min，降温至80℃后混匀。脱脂奶粉琼脂双层平板：9 cm直径的培养皿中注入融化的2%琼脂10 mL，冷凝后再注入脱脂奶粉琼脂培养基10 mL。液体种子培养基：牛肉膏5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、氯化钠5 g、水1000 mL，121℃灭菌15 min。豆粕培养基：豆粕 40 g、糖蜜 1 mL、水 34 mL，均装入 250 mL三角瓶，121℃灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株诱变条件确定 菌株JB在液体种子培养基中37℃培养了8 h即为出发菌株，灭菌水稀释成10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，各浓度分别涂布脱脂奶粉琼脂双层平板（试验组），所涂平板垂直置于30 W紫外灯下，15 cm照距照射10、20、30、40、50、60、90 s和 120 s， 设相应无照射对照组，照后黑布包好，37℃培养24 h，计算致死率，以试验组双层平板上适宜的菌落密度（6～12个）确定出发菌株最佳稀释浓度和照射时间。

1.2.2 菌株诱变及初筛 以上述条件为依据进行批量诱变，并以其培养后双层平板上的菌落直径（c）及透明圈直径（h）之比 K 值（h/c）进行初筛，取K值大于4的菌落纯培养，4℃保存备用。

1.2.3 菌株的复筛 初筛菌株于液体种子培养基37℃培养12 h活化用于复筛检测。其中蛋白酶活力、酸溶蛋白含量和游离氨基酸含量为菌株蛋白酶解能力的测定指标；而胰蛋白酶抑制因子含量和植酸含量为菌株降解抗营养因子能力的测定指标。

一部分活化菌液经Folin酚法测定蛋白酶活力（黄秀梨等，2008）。另取活化菌液5 mL接种到装有豆粕培养基的250 mL三角瓶中，37℃、72 h固态发酵，后进行检测。测定指标及方法如下：（1）三氯乙酸沉淀法测酸溶蛋白含量 （朱平军等，2011）；（2）以水合茚三酮法测游离氨基酸含量（何照范等，1998）；（3）以改进的 BAPNA 法测胰蛋白酶抑制因子含量（卢晓凌，2009）；（4）以三氯化铁比色法测植酸含量（傅启高等，1997）。以对出发菌的上述处理作为对照。

1.2.4 菌株鉴定 所获优良菌株通过菌体、菌落特征和生理生化特征进行鉴定。

1.2.4 数据处理 试验采用SPSS 13.0数据统计分析软件进行一维方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。试验结果均以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 菌株诱变条件 从表1可见，所试稀释梯度在处理时间分别为40、30和20 s时，相应平板上菌落数分别为50、10和3，同时各致死率亦均为75%。紫外线诱变育种中，往往以致死率确定诱变剂量，且在70%~80%时诱变效果最好，所以若只考虑到紫外诱变的剂量要求，则所试3个稀释梯度在照射时间40、30 s和20 s时完全符合（张克旭和陈宁，1998），但考虑到在9 cm直径的平板上观测菌落及其周围蛋白水解透明圈的可操作性及准确性，所以本试验在30 W紫外灯、照距15 cm的前提下，选择稀释梯度为10-7、菌落数为10及紫外线诱变时间为30 s的条件进行后续的菌种的批量诱变。

2.2 优良菌株诱变及初筛结果 经上述条件批量诱变后，共得到K值大于4的突变菌15株，命名为 JY1、JY2……JY15。

表1 不同诱变条件下平板上的菌落数/致死率%

2.3 优良菌株复筛结果 15株初筛菌株蛋白酶解能力和抗营养因子降解能力测定结果见表2和表3。

表2 初筛菌株蛋白酶活力及豆粕发酵后酸溶蛋白和游离氨基酸含量

表3 筛选后所获菌株的抗营养因子含量测定结果mg/g

由表2可见，15株菌蛋白酶活的表观测定值均较高， 尤其是菌株 JY15、JY13、JY11、JY14 和JY8与对照组的差值较大（P＜0.01）。说明这5株菌产蛋白酶能力较强。15株菌酸溶蛋白的表观测定值均较高，尤其是菌株 JY15、JY3、JY14、JY2 和JY12极显著高于对照组（P＜0.01）。酸溶蛋白一般是酶解天然大分子蛋白的产物，可以溶解在三氯乙酸中，分子质量均在10 kD以下，包括寡肽和游离氨基酸。这类酸溶蛋白在饲料中被动物机体的吸收率远高于天然大分子蛋白。所以说饲料中酸溶蛋白含量的提高即意味着饲料营养价值的提高。 因此菌株 JY15、JY3、JY14、JY2 和 JY12 在饲料微生物发酵中更具有使用价值。15株菌游离氨基酸表观测定值均较高，尤其是菌株JY2、JY9、JY11、JY12、JY13、JY14 和 JY15 的游离氨基酸表观测定值极显著高于对照组 （P＜0.01）。传统的蛋白质消化、吸收理论认为，蛋白质在肠腔内由胰蛋白酶和糜蛋白酶作用生成游离氨基酸和寡肽（也称小肽，含2～20个氨基酸残基，常指含2～6个氨基酸残基的寡肽），寡肽在肽酶的作用下完全被水解成游离氨基酸，并以游离氨基酸形式进入血液循环。所以传统理论认为游离氨基酸的含量决定了饲料的营养价值。

综合以上的结果，三个指标中均与对照组差异极显著的菌株有JY14和JY15，选择上述两株进行抗营养因子降解能力的验证。

由表3可见，JY14和JY15菌胰蛋白酶抑制因子含量与对照组比均达到差异极显著水平（P＜0.01）。同时，JY15与 JY14相比，差异也极显著（P＜0.01）。胰蛋白酶抑制因子一方面可与动物小肠液中胰蛋白酶结合成无活性的复合物，降低胰蛋白酶的活性，导致蛋白质消化利用率降低，造成外源氮损失；另一方面结合后胰蛋白酶大量补偿性分泌，造成蛋白质的内源性消耗、氨基酸代谢不平衡，影响动物机体生长。胰蛋白酶抑制因子的本质是蛋白质，其降低原因是微生物分泌的酶系，尤其是一些蛋白酶，对胰蛋白酶抑制因子产生了一系列的作用，使之部分降解。

经统计分析发现，上述两株菌植酸含量与对照组比均达到差异极显著水平（P＜0.01）。同时，JY15与JY14相比，差异也极显著（P＜0.01）。植酸在动物消化道的酸度条件下，会与二价金属离子、带正电的蛋白质、氨基酸发生反应，生成络合物及复合物，它们不仅基团之间亲和能力强，且其本身难溶解，不仅影响磷的利用率，同时还影响矿物质元素、蛋白质、氨基酸利用率，甚至对淀粉酶、脂肪酶的活性均有抑制作用。植酸是B族维生素的一种肌醇六磷酸酯，其降低的原因是微生物的大量繁殖将其消耗利用或产生的植酸酶使其含量下降。

2.4 菌株鉴定结果 该菌菌落呈扁平状，菌落扩散、边缘整齐，表面湿润，光滑，较黏稠；革兰氏染色阳性；芽孢为椭圆形，中生或侧生。生理生化特征为：好氧菌，接触酶反应为阳性。根据JY15菌株的形态和生理生化特征，并依据《微生物实验手册》和《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）进行菌种鉴定，该菌株为芽孢杆菌属（Bacillus）。

3 讨论

3.1 菌株的紫外线诱变 本研究中10-7稀释梯度下得到的10个菌落，在平板上表现为均匀分散、彼此独立、透明圈清晰可见。当诱变时间短、稀释倍数低时，诱变后平板上菌落虽然可计，但是透明圈相连，无法计算K值；而当诱变时间长、稀释倍数高时，其上的菌落数目则太少、外环境的轻微影响极易导致平板上无菌落，因此也不适宜批量操作。

对于菌株紫外线诱变步骤，大多试验研究均采用紫外线照射菌液，后吸取一定量涂布平板（鞠华伟等，2007；牛春华，2011）。然而实际操作却发现此方法得到的菌落数目极其不稳定。原因有两个：一是培养皿底凹凸不平；二是吸取诱变菌液的含菌量（菌个数）难以恒定。为此本研究中，巧妙的采用紫外线照射涂布菌液后的平板，而使得各平板上的菌落数稳定一致，便于批量操作，为紫外线诱变育种的照射环节开拓了一个简便、易行的良好方法。

3.2 菌株发酵对原料中蛋白含量的影响 传统理论认为蛋白质是为动物机体提供氨基酸的营养源，且只有游离氨基酸才可被动物机体吸收利用；而新的观点则认为寡肽的吸收更具优越性，因其不仅具有高效吸收、低耗能等特点，又可避免游离氨基酸之间的吸收竞争，同时一定的寡肽和游离氨基酸比例也会促进动物的吸收作用，因此通过酸溶蛋白含量测定评估饲料蛋白的优劣便成为了现阶段被广泛推广的方法。而本试验采用检测蛋白酶解能力的两个指标：酸溶蛋白含量和游离氨基酸含量，兼顾了传统理论，将新旧观点做了最大限度的平衡。

4 小结

本试验获得的菌株JY15发酵豆粕可提高其小分子蛋白含量，同时也降低了抗营养因子水平（P ＜ 0.01）。

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