肢体反复短暂缺血预处理在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用

张晓敏，李光来

脑血管病是现实生活中危害人类生命健康的常见病和多发病，以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率受到医学界的广泛关注。在脑血管病的治疗中，肢体反复短暂缺血预处理（LEP）在脑保护方面的研究是近年研究的热点之一，但对于其具体机制仍不十分明确和完善，因此进一步探讨肢体反复短暂缺血预处理在脑缺血再灌注损伤中的保护作用尤为重要。本课题通过观察肢体反复短暂缺血预处理时对大鼠脑缺血及缺血再灌注脑组织超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）及三磷酸腺苷（ATP）酶水平的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护作用，为脑缺血患者的临床治疗提供一条安全、无创、有效的新途径，达到及时指导、早期治疗、提高患者生存率和生存质量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 在山西医科大学实验动物中心选取成年健康雄性Wistar大鼠42只，鼠龄3个月～4个月，体重200g～250g。

1.1.2 实验分组 42只 Wistar大鼠，随机分为假手术组（A

组）、脑缺血组（B组）、脑缺血再灌注组（C组）、LIP组（D组）。LIP组再分为4组：LIP 0h组（D1组）、LIP 6h组（D2组）、LIP 12h组（D3组）、LIP 24h组（D4组），分别在LIP后即刻、6h、12h、24h行脑缺血再灌注。每组各6例。

1.1.3 实验设备 721分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；TGL－16G高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械厂）；XW－80A漩涡混合器（上海手术器械厂）；医用低温冰箱（日本三洋公司）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；JY98－ⅢN超声波破碎仪（上海京工实业有限公司）；光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.1.4 主要试剂 微量MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、超微量ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝蛋白含量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。普通试剂由山西医科大学实验中心提供。721分光光度计，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型的制备 采用改良Longa法［1］建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。将大鼠用10%水合氯醛3mL／kg腹腔麻醉，颈正中右旁开0.5 cm～1cm切口，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口，将直径0.236mm的进口鱼线插入，以分岔口处开始测量距离，插入1.8cm～2cm后固定鱼线，缝合。缺血2h后将线栓拉出1cm左右即可，形成再灌注。其中假手术组插入1.0cm鱼线。神经功能缺损评分按照Longa等［1］的5级4分法标准。

1.2.2 肢体反复短暂缺血预处理方法 大鼠仰卧固定，根据气压式肢体循环促进仪构造［2］自制小型充气气囊设备，在双侧股动脉处充气10min夹闭股动脉造成肢体缺血，松气再灌注10 min，反复4次。

1.2.3 神经功能缺陷评分标准 采用Longa等的5级4分法。0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度局灶性神经功能缺损，即提尾不能伸展左侧前爪；2分：中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识水平下降。

1.2.4 实验注意事项 实验过程中的动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。实验过程中，适当用白炽灯照射动物，维持其肛温在37℃左右，直到恢复活动，室温保持20℃以上，除去未出现相应脑缺血体征或缺血后出现癫痫及生命体征不平稳的大鼠。

1.2.5 脑组织病理切片的制备及MDA、SOD、ATP含量的测定 各组大鼠缺血2h再灌注24h后行神经功能评分后颈椎脱臼处死，在冰盘上快速取脑，置0℃～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，各组随机取1只大鼠右侧脑组织迅速固定，石蜡包埋后，在海马部位做矢状切片，厚约5μm，HE染色，观察脑组织变化。剩余右侧脑组织加入9倍量的0℃～4℃生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆，3 000r／min离心15min，取上清液检测MDA、SOD、ATP。严格按照试剂盒说明书步骤要求操作，计算出各项指标含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件处理数据，定量资料用均数±标准差（±s）表示，各组间定量资料的比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜下脑组织HE染色结果 A组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。B组、C组神经细胞变性坏死明显，胞体肿胀，周围间隙增宽，结构不清，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。D组神经细胞呈轻度缺血改变，变性坏死不明显，胞体呈轻度肿胀，神经细胞缺失较B组、C组轻。

2.2 各组脑组织SOD活力、MDA含量比较 各组中SOD活力的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），B组、C组、D组的SOD值均低于A组。D1组、D2组与B组和C组比较差异有统计学意义，且SOD值均高于B组，推测预处理初期有效。D3组、D4组与D1组、D2组比较差异有统计学意义。各组中MDA含量的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），B组、C组、D组的MDA值均高于A组。D1组、D2组、D3组、D4组与B组及C组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且MDA值均低于B组、C组，说明预处理后 MDA含量有所下降。D3组、D4组与D1组比较差异有统计学意义。详见表1。

表1 各组中SOD活力与MDA含量的比较（±s）

表1 各组中SOD活力与MDA含量的比较（±s）

MDA含量nmol／mgp组别 n SOD活力U／mgprot rot 6 135.08±4.21 1.55±0.38 B组 6 96.65±4.121） 3.98±0.211）C组 6 98.19±4.761） 3.13±0.611）2）D1组 6 121.94±8.331）2）3） 1.95±0.472）3）D2组 6 116.67±10.341）2）3） 2.34±0.471）2）3）D3组6 103.83±5.661）4）5） 2.62±0.381）2）3）4）D4组6 101.66±3.201）4）5） 2.53±0.451）2）3）4）与A组比较，1）P＜0.05；与B组比较，2）P＜0.05；与C组比较，3）P＜0.05；与D1组比较，4）P＜0.05；与D2组比较，5）P＜0.05 A组

2.3 各组脑组织 ATP含量比较 各组中 Na＋－K＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋－ATP含量的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且B组、C组、D3组、D4组 Na＋－K＋－ATP含量均低于 A组（P＜0.05）。D1组、D2组、D3组、D4组 Na＋－K＋－ATP含量均高于 B组与 C组（P＜0.05）；D1组、D2组 Ca2＋－Mg2＋－ATP含 量 均 高 于 B 组 （P＜0.05）。D3 组、D4组 Na＋－K＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋－ATP含 量 低 于D 1组 、D 2组 （P＜0.05）。各组中总ATP含量的比较差异有统计学意义（P＜0.05），且ATP含量均低于A组。D1组、D2组总ATP含量高于B组（P＜0.05）。D1组总ATP含量高于C组（P＜0.05）。D3组、D4组总ATP含量均低于D1组（P＜0.05）。详见表2。

表2 各组中ATP含量比较（±s）

表2 各组中ATP含量比较（±s）

组别 n Na＋－K＋－ATP Ca2＋－Mg2＋－ATP 总6 8.09±0.99 5.56±0.67 21.15±2.27 B组 6 2.89±0.651） 1.94±0.571） 15.54±2.071）C组 6 4.08±0.731）2） 2.37±0.561） 16.57±2.641）D1组 6 7.77±1.002）3） 4.80±0.741）2）3） 20.67±2.162）3）D2组 6 7.37±0.782）3） 4.79±0.541）2）3） 18.26±2.521）2）D3组 6 6.39±0.851）2）3）4）5）2.76±0.421）2）4）5） 17.74±1.711）4）D4组 6 5.37±0.691）2）3）4）5）2.32±0.461）4）5） 17.33±1.311）4）与A组比较，1）P＜0.05；与B组比较，2）P＜0.05；与C组比较，3）P＜0.05；与D1组比较，4）P＜0.05；与D2组比较，5）P＜0.05 ATP A组

3 讨 论

近年来对肢体反复短暂缺血预处理在脑缺血再灌注损伤中的保护作用方面的研究较多，但对于其具体作用机制方面的研究较少。本课题通过观察大鼠肢体反复短暂缺血预处理时脑组织SOD、MDA及ATP酶水平的影响，探讨其在脑缺血及缺血再灌损伤中可能的保护作用，以指导临床中脑缺血患者的治疗，提高患者的生存率，减少复发率及致残率，提高患者的生存质量。

本实验通过LIP后对大鼠脑组织MDA、SOD含量及ATP酶活性变化进行统计学分析，观察LIP在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用，结果显示大鼠脑缺血再灌注时大脑出现明显损伤性改变，经过股动脉反复4次短暂（10min）夹闭的LIP可使1d内脑缺血引起的神经元损伤有所改善，即通过观察肢体反复短暂缺血再灌注0h、6h、12h、24h大鼠脑组织 MDA、SOD、ATP的变化情况，结果发现反复短暂肢体缺血再灌注后大鼠脑组织中 MDA、ATP早期即有明显的升高，12h、24h升高不明显。这些结果表明LIP可以对远隔器官脑缺血再灌注损伤产生对抗作用，但间隔时间过长，LIP的这种保护作用有所减弱。这与Lepore等［3］研究发现大鼠后肢损伤性缺血前1d给予缺血预处理不能改善肌肉的生存状况，认为LIP对后续的肢体缺血再灌注损伤不能产生延迟性保护作用结果相一致。分析其相关机制可能为：①脑缺血后血流重建时缺血区自由基增多，与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应［4］，分解产生MDA，使脑组织生物膜结构破坏、蛋白降解、核酸主链断裂、透明质酸解聚、细胞崩解，脑细胞发生不可逆性损害，导致神经元死亡。②SOD作为体内清除自由基的首要物质，通过清除超氧阴离子自由基保护神经细胞免受损伤。③脑缺血再灌注早期，脑细胞内ATP合成减少，依赖ATP的离子泵，尤其是Na＋－K＋－ATPase功能减弱，使大量Na＋内流，K＋外流，细胞膜电位下降产生去极化，从而引起突触前膜释放兴奋性氨基酸，兴奋性氨基酸主要通过受体活化方式而起兴奋性介质作用，受体活化效应主要引发大量的Ca2＋内流，同时激活细胞内Ca2＋库的释放，导致细胞内游离Ca2＋超载，激活了各种降解酶，引起DNA、蛋白质和磷脂降解，细胞代谢、结构与功能多方面的异常改变，神经细胞逐步死亡。有文献表明，细胞内Na＋增多，导致渗透压升高，是再灌注早期脑细胞内水肿和神经细胞坏死的重要原因［5］。同时过量Ca2＋沉积于线粒体，使线粒体氧化磷酸化失偶联进一步加重，膜电位丧失，导致细胞能量的严重丢失，同时致使O2经单电子还原生成超氧阴离子（O2－）增多，产生的大量自由基引起膜脂质过氧化，导致膜结构破坏，线粒体功能障碍，细胞膜通透性也增加，发生细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用。此外有学者研究发现，LIP能明显对抗后续即刻给予的损伤性脑缺血再灌注引起的大鼠海马CA1区延迟性神经元死亡，并从LIP后NO动态变化、C－Fos、Hsp蛋白的表达，神经途径阐释了LIP对脑缺血再灌注损伤保护作用的可能机制［6－8］。

反复短暂肢体缺血预处理是一种便捷、安全、有效的脑保护方法，对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与增加自由基清除酶SOD活性，抑制脂质过氧化反应，降低MDA含量有关。通过促进脑缺血再灌注后线粒体脂肪酸代谢，提高糖代谢，加速ATP产生，及早恢复缺血半暗区能量供应，阻断后续的链式神经元损伤反应，产生神经细胞保护作用有关。Na＋－K＋－ATPase活性升高可纠正细胞内酸中毒，Ca2＋－Mg2＋－ATPase活性升高可纠正Ca2＋超载，反复短暂肢体缺血预处理通过提高脑缺血再灌注后 Na＋－K＋－ATPase和Ca2＋－Mg2＋－ATPase活性，维持钠泵、钙泵的稳定，使细胞内外Na＋、Ca2＋平衡，从而稳定神经细胞膜电位，起到神经细胞保护作用。

虽然本实验将预处理组区分了四个时间点，但LIP对缺血再灌脑保护的具体时间窗有待进一步研究，在以后的试验中需更详细的制定时间窗以及对其他相关机制进一步研究。

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［2］赵玉玺.气压式肢体血液循环促进仪的设计［J］.液压与汽动，2006（2）：31.

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［5］张三妹，李光来.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤后ATP酶的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（2）：186－188.

［6］赵红岗，李玉洁，李文斌，等.肢体反复短暂缺血再灌注后脑组织一氧化氮的动态变化［J］.中国临床康复，2005，9（9）：67－70.

［7］赵红岗，李文斌，孙晓彩.神经途径在肢体缺血预处理抗脑缺血／再灌注损伤中的作用［J］.中国应用生理学杂志，2007，23（1）：19－25.

［8］Zhan HG，Li WB，Li QJ，et al.Limb ischemic preconditioning attenuates apoptosis of pyramidal neurons in the CA1hippocampus induced by cerebral ischemia－reperfusion in rats［J］.Acta Physiologica Sinica，2004，56（3）：407－412.