上海市某结核病定点医院结核病房空气样本中分枝杆菌的检测

江渊 刘轾彬 桂晓虹 沈鑫 张忠顺 肖和平 梅建

肺结核是严重危害公众健康的呼吸系统传染病之一，结核病定点医院是结核病患者集中诊断、治疗和康复的场所，其空气质量关系着患者及医务人员的身心健康［1］。为了解痰涂片抗酸杆菌阳性患者病房空气中是否存在结核分枝杆菌，笔者对上海市某结核病患者定点收治医院结核病房中的空气样本进行了分枝杆菌的检测和鉴定，为预防医院内感染、控制和管理提供客观的事实依据，以减少医院感染的发生。

材料和方法

一、材料和试剂

1．空气样本来源：采集2009年6—10月间上海市某结核病患者定点收治医院22间结核病房中空气样本134份，均在痰涂片抗酸杆菌阳性（＋～＋＋＋＋）患者床边采集。每间病房均有4张床位，每间病房的空间布局相同但患者组成情况不完全相同。床边采样患者入院时的临床诊断均为痰菌阳性的肺结核，入院后根据痰培养及菌种鉴定结果诊断为：肺结核或者非结核分枝杆菌病。这22间病房同期收住的其他患者分别为肺结核（50%左右）、结核性胸膜炎（20%左右）、肺癌（10%左右）、肺炎（10%左右），其余为非结核分枝杆菌病、陈旧性肺结核和结核性脑膜炎患者。诊断依据参照中华医学会《临床诊疗指南：结核病分册》［2］及其他呼吸系统疾病的临床诊疗指南（中华医学会丛书）。采样时间为患者入院当天或第二天（患者入院后24h内），在医院对患者进行抗结核治疗前进行采样，采样时门窗关闭。

2．主要仪器和试剂：液体撞击式微生物气溶胶采样器（FA－1型撞击式空气微生物采样器）为辽阳市康洁仪器研究所产品，BacT／ALERT 3D全自动快速培养仪及液体培养基为法国生物梅里埃（中国）股份有限公司产品，3130基因分析仪及相应试剂为美国应用生物系统（Applied Biosystems）公司产品，抗酸染色液为珠海贝索生物技术有限公司产品，罗氏培养基由上海市疾病预防控制中心培养基室提供，氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等为中国医药（集团）上海化学试剂公司产品（分析纯）。

二、方法

（一）空气样本的采集方法

采用液体撞击式微生物气溶胶采样器（FA－1型撞击式空气微生物采样器），在采样瓶中加入无菌生理盐水10ml作为采样介质，进行空气采样。采样时，采样器进气口放置距离地面1．2m处，同时将进气口对着采样患者（距离小于1m），流量控制在9L／min左右，采样时间为30min，每位患者床边采样1份。每份空气样本采集后，在生物安全柜中将10ml采样液收集至无菌50ml离心管中，送至我实验室进行分枝杆菌分离培养。

（二）空气样本前处理

每份空气样本中加入等量氢氧化钠－N－乙酰－L－半胱氨 酸 （N－acetyl－L－cysteine－sodium hydroxide，NALC－NaOH）前处理液［3］消化15～20min后，再加入PBS缓冲液（pH值为6．8）至终体积45ml，4℃条件下3000×g离心15min，弃上清。沉淀加入0．7ml PBS缓冲液（pH 值为6．8），吹打混匀后，用于后续分离培养试验。

（三）样本中分枝杆菌分离培养

经过前处理的样本接种于BacT／ALERT 3D液体培养管和中性罗氏培养基，分别置于BacT／ALERT 3D全自动快速培养仪和37℃培养箱中培养。BacT／ALERT 3D快速液体培养按照法国生物梅里埃（中国）股份有限公司提供的“BacT／ALERT 3D系统操作手册”（Version B．01版）进行，样本接种罗氏培养基按《结核病诊断细菌学检验规程》进行［3］。

（四）培养阳性样本的确认及菌型鉴定

1．阳性培养物涂片抗酸染色确认：BacT／ALERT 3D液体培养和罗氏培养阳性后需经涂片抗酸染色确认为抗酸杆菌。抗酸染色镜检及其结果的判定按《结核病诊断细菌学检验规程》进行［3］。

2．培养阳性的分枝杆菌经DNA序列分析进行菌型鉴定：DNA模板的制备按照煮沸裂解法进行提取。从罗氏培养基上刮取1～2接种环阳性培养物，重悬于200μl TE溶液中，80℃灭活30min（BacT／ALERT 3D培养阳性样本，转种至中性罗氏培养基，待菌落生长至对数生长期后进行上述操作）。灭活后的菌株DNA 100℃水浴10min煮沸裂解，立即置冰上2min，13 000×g离心15min后，取上清置于另一无菌1．5ml EP（eppendorf tubes）管中，－20℃保存备用。

根据16SrRNA编码基因保守区设计通用引物：P1：5′－TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；P2：5′－ACCGCGGCTGCTGGCAC－3′。PCR 扩 增模板DNA，反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，经过35个循环，最后72℃延伸5min。然后对PCR产物进行DNA测序分析（实验室自测，PCR产物同时送上海桑尼生物科技有限公司测序，复核测序结果），测序完成后，利用序列分析软件Sequencing Analysis 5．3，得到电泳图谱及基因序列。最后将16SrRNA结果与GenBank上标准序列包括结核分枝杆菌标准序列M．tuberculosis（ATCC 27294）、胞内分枝杆菌标准序列M．intracellulare（DSM 43223）、戈登分枝杆菌标准序列M．gordonae（Borste 9411／99）比对，分析鉴定该菌种。

（五）统计学方法

使用SPSS 15．0软件对检测数据进行分析：以传统的罗氏培养方法培养结果为金标准，BacT／ALERT 3D液体培养方法与罗氏培养方法对医院空气样本中分枝杆菌分离率的比较采用配对卡方检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

（六）质量控制

每批试验均设立阳性对照和阴性对照，结核分枝杆菌标准菌株H37Rv（ATCC 27294）作为阳性对照质控菌株，以灭菌PBS缓冲液（pH值为6．8）为阴性对照。在两种分离培养方法操作规程规定的报告时间内，接种H37Rv的培养基中应有结核分枝杆菌生长，接种灭菌PBS缓冲液的培养基中不应有细菌生长。

结 果

1．分枝杆菌分离培养：在结核病房痰涂片抗酸杆菌阳性患者床边采集到的134份空气样本中，有3份样本分枝杆菌分离培养阳性。

134份空气样本经BacT／ALERT 3D液体培养方法培养阳性3份，阳性检出率为2．3%（3／132），污染2份，污染率为1．5%；经罗氏培养方法培养阳性2份，阳性检出率为1．5%（2／133），污染1份，污染率为0．7%；两种培养方法共同培养阳性2份。经配对卡方检验，两种培养方法对医院空气样本中分枝杆菌分离率差异无统计学意义（P＞0．05），详见表1。

表1 BacT／ALERT 3D液体培养法与罗氏培养法对医院空气样本中分枝杆菌检出情况（份）

2．分枝杆菌菌型鉴定：3份培养阳性样本，分别进行涂片抗酸染色确认为抗酸分枝杆菌后，进行菌型鉴定。经DNA序列分析比对，分别为结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌和戈登分枝杆菌。

图1 分枝杆菌16SrRNA基因PCR扩增结果

3．培养阳性的3份样本其来源病房的患者情况：具体见表2。其中戈登分枝杆菌阳性标本患者入院时已于外院抗结核治疗2个月，外院痰涂片＋。而胞内分枝杆菌来源患者入院时已于外院抗结核治疗1年余，外院痰涂片＋。结核分枝杆菌阳性标本来源患者入院时已于外院抗结核治疗2个月，外院痰涂片＋。

讨 论

在结核病定点收治医院的特定环境中，空气中分枝杆菌的污染可能是导致结核病院内感染的重要媒介［4－5］。肺结核通过空气中的带菌气溶胶传播，结核分枝杆菌气溶胶主要来自患者咳嗽、打喷嚏等直接喷出的带菌飞沫，其次由落在物体表面的结核分枝杆菌随尘土漂浮到空气中形成的再生菌尘气溶胶［6］。

1．对134份采自结核病房痰涂片抗酸杆菌阳性住院患者床边空气样本分离培养结果的分析：本研究中，检测的134份空气样本分别采自不同结核病房痰涂片抗酸杆菌阳性（＋～＋＋＋＋）患者病床边。其中有3份空气样本分枝杆菌培养阳性，结合DNA测序结果分析，分别为：结核分枝杆菌、致病性的胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌。1例胞内分枝杆菌来自于痰菌阳性的非结核分枝杆菌肺病患者的床边采集样本，同病房其他3位患者的临床诊断分别为：结核性脑膜炎、陈旧性肺结核；结核性脑膜炎、血行播散性肺结核；左肺鳞癌。这3位患者痰样本中均未分离培养出分枝杆菌。但是医院对该采样病床患者的痰标本临床分离菌株仅鉴定到非结核分枝杆菌，笔者没有获得该患者的临床菌株，无法进一步鉴定是否为胞内分枝杆菌，亦无法进行菌株基因型的比对分析，对于空气中分离到的菌株是否为该患者呼吸道排出缺乏实验室数据的支持。1例结核分枝杆菌来自于菌阳肺结核患者的床边采集样本，同病房其他3位患者均为菌阳肺结核患者。但是由于没有获得这4位患者的痰标本临床分离菌株，未进行菌株基因型的比较分析，因此无法判断空气中分离到的菌株与患者感染的菌株是否存在同源性。另外1例空气样本中分离培养出戈登分枝杆菌，采样病床患者在该医院入院后检查痰菌阴性，同病房其他3位患者中2位为痰菌阳性的肺结核患者，1位为痰菌阴性的肺结核患者。由于自然界中本身就存在戈登分枝杆菌，结合空气样本采集时病房收住患者情况分析，病房收住的患者中没有感染戈登分枝杆菌的非结核分枝杆菌病患者，该例戈登分枝杆菌可能是由住院患者及其家属从环境中带入病房。另外，在课题最初设计的时候，课题研究目的仅想了解收住菌阳肺结核患者的结核病房空气中是否存在分枝杆菌，及收住菌阳肺结核患者的结核病房空气中是否有传播结核病的风险，所以各病房患者病情轻重及各病房收住患者情况并不完全相同，患者的病情轻重不完全相同，所以没法判断这些因素对病房空气中菌含量是否有影响。

表2 培养阳性的3份样本其来源病房的患者情况

2．空气样本中分枝杆菌分离培养方法的选择：在空气样本中分枝杆菌的分离培养方法上，本研究采用了世界卫生组织推荐的NALC／NaOH消化法消化－去污染后分别接种至中性罗氏培养基和BacT／ALERT 3D快速液体培养基进行分枝杆菌的分离培养。134份空气样本经BacT／ALERT 3D液体培养方法培养阳性3例，经罗氏培养方法培养阳性2例，2种培养方法共同培养阳性2例，2种培养方法对医院空气样本中分枝杆菌分离率经配对卡方检验（P＞0．05），差异无统计学意义。但BacT／ALERT 3D液体培养试验成本较高，不适宜作为空气样本常规检测的首选方法，因此建议使用分枝杆菌罗氏培养作为医院空气定期监测的常规方法，但是标本在首次分离时建议BacT／ALERT 3D液体培养与传统罗氏培养法联合使用，以提高检出率，保证空气监测效果。

3．对于预防院内感染的一些建议：卫生保健工作人员 （HCW）医院内结核感染问题不容忽视。Menzies等［7］采用文献调研的方法，对部分中低收入国家的HCW结核感染情况进行了调查，结果显示中低收入国家中HCW的结核发病率远高于一般人群。近年来，非结核分枝杆菌引起院内感染的问题也越来越受到专家的重视。本研究结果显示，该结核病患者定点收治医院在结核病房涂阳患者床边采集的空气样本中可分离培养出结核分枝杆菌，以及其他致病性非结核分枝杆菌。虽然目前无法判断这些菌株是否由于当时住院患者传播所致，但是这一结果提示：（1）加强环境管理，结核病房定期开窗通风和进行紫外线消毒，从而切断结核分枝杆菌的继续传播途径；（2）对医院空气进行定期检测，及时掌握空气质量；（3）加强院内健康教育，提高医护人员、患者及其家属的自我防护意识；（4）加强医护人员、患者及其家属的个人防护措施；以切实保护医护人员、患者及其家属的身体健康，控制院内感染。同时本研究结果也提示，不但菌阳结核病患者房间有病原体存在和传播的风险，非结核分枝杆菌痰菌阳性的患者房间也有病原体存在和传播的风险，同样需要引起防控机构的重视。

综上所述，该医院结核病房痰涂片抗酸杆菌阳性患者床边所采集的空气样本中可分离到分枝杆菌，虽然目前尚无法判断这些菌株是否由于就诊患者传播所致，但是这一研究结果提示：定期监测医院内空气质量是防控医院内感染的一项重要措施。同时，本研究结果也提示：不但菌阳结核病患者的房间有病原体存在和传播的风险，非结核分枝杆菌痰菌阳性的患者房间也有病原体存在和传播的风险，同样需要引起防控机构的重视。由于本研究没有获得空气样本采集时病房中收住患者的痰标本临床分离菌株，因此无法确定空气中检测到的分枝杆菌是来源于被检患者、同病房其他患者还是到该医院就诊的其他患者，甚至是否来源于外环境。本研究也为今后结核病医院内空气质量监测提供了一个借鉴：在进行结核病房空气监测时，同时期病房收住患者的治疗情况、采样时是否排菌，以及临床分离菌株的收集与保存也不容忽视，将空气中分离得到的菌株基因型与患者的痰标本临床分离菌株基因型进行比较分析，能够更严谨地为病房空气中分离到病原体的来源提供科学依据。

［1］王芳，易滨，刘军，等．结核分枝杆菌医院感染现状及预防控制措施研究．中华医院感染学杂志，2009，19（21）：2927－2929．

［2］中华医学会．临床诊疗指南：结核病分册．北京：人民卫生出版社，2005．

［3］中国防痨协会基础专业委员会．结核病诊断细菌学检验规程．北京：中国教育文化出版社，2006：13－45．

［4］邢玉斌，魏华，索继江，等．空气消毒器现场消毒效果评估．中华医院感染学杂志，2006，16（7）：774－775．

［5］武迎宏，邓明卓，申玉玲，等．人员流动状态下空气消毒效果的观察．中华医院感染学杂志，2007，17（7）：828－830．

［6］张本，王忠仁，童小玫，等．结核病房空气中结核分支杆菌检测方法研究．中华结核和呼吸杂志，1997，20（2）：101－103．

［7］Menzies D，Joshi R，Pai M．Risk of tuberculosis infection and disease associated with work in health care settings．Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（6）：593－605．