用于PCR 扩增的细菌DNA 提取方法比较

冯广达，陈美标，羊宋贞，朱红惠

(广东省微生物研究所/广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/广东省菌种保藏与应用重点实验室/广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070)

随着分子生物学技术的不断进步，许多非培养法在微生物学领域的研究中得到广泛应用［1-4］.尽管如此，传统的平板分离及鉴定工作仍然是获取微生物资源最直接的方式，发挥着不可替代的作用.菌株遗传信息的获取对于明确其分类地位必不可少，因此需要提取DNA 进行基因扩增和测序.采用CTAB法［5］、SDS 法［6］或基因组提取试剂盒提取DNA 均具有较好的效果，但在菌株数量较多的情况下，这些方法仍存在耗时长或费用高等问题.此外，CTAB 法和SDS 法提取DNA 的过程中还会产生酚、氯仿等有机污染物.针对该问题，本研究以不同属的革兰阴性菌和阳性菌为研究对象，比较了4 种简单提取细菌DNA 方法的效果，为其在细菌资源发掘和鉴定中的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

革兰阴性菌7 株，包括:Escherichia coli ATCC 8739、Acinetobacter sp.1PNM-1、Massilia sp.1PNM-3、Sphingomonas sp.1PNM-9、Herbaspirillum sp.9PNM-13、Ralstonia sp.6HR-14 和Moraxella sp.1NM-7.革兰阳性菌8 株，包括:Bacillus subtilis ATCC 6633、Staphylococcus aureus ATCC 6538、Deinococcus sp.1PNM-7、Arthrobacter sp.9PNM-1、Curtobacterium sp.6PNM-17、Staphylococcus sp.1NM-17、Streptomyces sp.6PNM-9 和Kocuria sp.1PNM-16.其中，Escherichia coli ATCC 8739、Bacillus subtilis ATCC 6633 和Staphylococcus aureus ATCC 6538 由广东省微生物菌种保藏中心提供，其余菌株均分离自矿区.

1.2 试剂及仪器

酵母提取物和蛋白胨(Oxoid，UK)，酸水解干酪素、琼脂糖和十二烷基肌氨酸钠(Sigma，USA)，丙酮酸钠(国药集团，上海)，EasyTaqTMDNA 聚合酶(全式金，北京)，dNTP 和Maker DL5000(东盛生物，广州)，引物合成(英骏，上海);PCR 仪(Biometra Tprofessional，Germany)，离心机(Sigma，USA)，电泳仪(六一，北京).

1.3 DNA 提取

将供试菌株分别接种于R2A［7］液体培养基中，30℃、150 r/min 振荡培养至对数期后期或稳定期，菌液浑浊.每个菌株分别取2 mL 菌液于4 个离心管中，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液.收集的菌体分别按下述4 种方法进行处理.

1.3.1 冻融法 向离心管中加入500 μL 的无菌双蒸水，采用液氮将离心管冷冻后，置于99℃水浴5 min，取出后涡旋30 s，重复上述操作1 次.12 000 r/min离心，以上清液作为模板.

1.3.2 煮沸法［8］向离心管中加入500 μL 无菌双蒸水，涡旋30 s，置95℃水浴5 min，12 000 r/min 离心2 min.以上清液作为模板.

1.3.3 碱解法［9］加入50 μL 0.5 mol/L NaOH 溶液于离心管中，涡旋30 s.取5 μL 液体用无菌的0.1 mol/L Tris (pH 8.0)溶液稀释100 倍，以稀释液作为模板.

1.3.4 ROSE 法［10］向离心管中加入200 μL ROSE Buffer［10 mmol/L Tris (pH8.0)，312.5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，10 g/L 十二烷基肌氨酸钠，10 g/L 聚乙烯聚吡咯烷酮］，涡旋30 s，置90℃水浴20 min 后，冰浴5 min，取10 μL 液体用无菌双蒸水稀释100 倍，以稀释液作为模板.

1.4 PCR 扩增

采用细菌 16S rRNA 基因引物 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3')［11］对15 株细菌分别进行PCR 扩增.25 μL 反应体系包括:10× Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，Taq 酶1.25 U，模板2 μL，ddH2O 定容至25 μL.PCR 扩增程序:95℃预变性3 min;进入PCR 循环，94℃30 s，56℃30 s，72℃1.5 min，30 个循环;72℃延伸20 min.PCR 产物采用添加了Goldview 的10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图谱来判断4 种细菌DNA 提取方法的效果.对其中提取效果较好的方法，增加DNA 提取及PCR 扩增的重复试验2 次，以验证方法的稳定性.

2 结果与分析

2.1 细菌DNA 提取效果比较

分别采用4 种方法提取了15 株细菌的总DNA，以之为模板进行了16S rRNA 基因的PCR 扩增.电泳结果如图1 所示，以冻融法、煮沸法和碱解法提取的不同属的革兰阴性菌的总DNA 为模板，均能够成功用于16S rRNA 基因的PCR 扩增，目的片段大小约为1.5 kb，而采用ROSE 法提取的7 株革兰阴性菌的总DNA 中，仅Escherichia、Acinetobacter、Massilia 和Moraxella 4 个属的菌株得到了较好的PCR 扩增效果，而其他3 个属的菌株PCR 扩增效果较差或失败.4 种方法对革兰阳性菌总DNA 的提取效果也存在较大的差异，采用冻融法成功提取了7 株不同属的革兰阳性菌菌株的总DNA，仅Staphylococcus aureus ATCC 6538 的总DNA 未能成功提取.采用煮沸法则成功提取了5 株革兰阳性菌的总DNA，但提取的Staphylococcus aureus ATCC 6538、Deinococcus sp.1PNM-7 和Streptomyces sp.6PNM-9 的PCR 效果较差或失败.采用碱解法和ROSE 法仅能成功提取4 株革兰阳性菌的总DNA，而对Deinococcus sp.1PNM-7、Arthrobacter sp.9PNM-1、Streptomyces sp.6PNM-9 和Kocuria sp.1PNM-16 的提取效果较差或失败.增加冻融法和煮沸法的2 次重复试验分别取得了与图1a和图1b 相同的效果，证明这2 种方法均具有较好的稳定性.

图1 不同DNA 提取方法的PCR 扩增效果Fig.1 PCR amplification of bacteria DNA extracted by different methods

冻融法和煮沸法提取DNA 原理均为物理作用裂解细胞，两者对Staphylococcus aureus ATCC 6538的总DNA 提取均未成功，但前者对Deinococcus 和Streptomyces 属菌株的总DNA 提取效果均优于煮沸法.碱解法和ROSE 法均为化学作用裂解细胞，在革兰阴性菌的总DNA 提取效果上碱解法优于ROSE法，与冻融法和煮沸法取得了相似的效果，但在革兰阳性菌的DNA 提取上，两者效果均较冻融法和煮沸法差.碱解法和ROSE 法均能够成功提取Staphylococcus aureus ATCC 6538 的总DNA，而该菌株采用物理裂解的方法均未成功，这说明化学作用在裂解革兰阳性菌的细胞方面具有一定的优势，但它们对Deinococcus、Arthrobacter、Streptomyces 和Kocuria 属的菌株DNA 提取均未成功.总体而言，对细菌总DNA的提取效果排序依次为冻融法、煮沸法、碱解法、ROSE 法，冻融法效果最好.

2.2 细菌DNA 提取操作规程

本研究表明了冻融法的DNA 提取效果要优于煮沸法，但并不能成功提取所有菌株的总DNA，尤其是革兰阳性菌.针对该问题，我们提出了如图2 所示的操作规程.先对大量分离的菌株进行液体培养，待对数期取部分菌液用于甘油种制备.剩余的菌液按照冻融法进行前处理，以获得的上清液为模板进行16S rRNA 基因的PCR 扩增.对于少数扩增效果差或失败的菌株，则弃上清液，采用CTAB、SDS 法或试剂盒再次提取其总DNA 进行补充，以确保获取菌株的遗传信息.

图2 细菌DNA 提取操作规程Fig.2 Operational procedure of bacteria DNA extraction

3 讨论与结论

微生物资源获取的过程中往往需要分离大量菌株，并通过16S rRNA 基因的PCR 扩增及测序了解其分类地位.因此，DNA 的提取成本和效率尤为重要.目前许多学者仍采用化学裂解的方法(如SDS、CTAB 等)提取细菌的总DNA［12-16］，这些方法不仅耗时耗力，且会产生大量的酚和氯仿等有机污染物.尽管市售的基因组DNA 提取试剂盒具有省时和效率高的优点，但在菌株较多和经费有限的情况下成本依然较高.为此，本研究以来自14 个属的革兰阴性和阳性细菌菌株为研究对象，对4 种简单提取细菌DNA 方法的效果进行了比较.研究结果表明在细菌DNA 的提取效果上进行排序，依次为冻融法、水煮法、碱解法、ROSE 法，冻融法效果最好，理论上，碱解法和ROSE 法采用化学作用的方式应更有助于细胞的裂解和DNA 的释放，但在实际操作过程中，我们发现部分细菌的胞内物与化学裂解液反应后会形成大量的黏稠状物质，这种现象在革兰阳性菌中更为突出，而这2 种方法又缺少了酚/氯仿/异戊醇的纯化步骤，使得DNA 释放和溶解都较为困难，这些黏稠状物质可能也影响到了DNA 聚合酶的活性，导致部分菌株的PCR 扩增失败，尝试采用高速离心仍无法解决该问题.钱雪琴等［17］对E.coli ATCC 25922 和Staphylococcus aureus ATCC 25923 利用碱解法提取DNA 用于PCR 扩增也均告失败.冻融法和煮沸法虽为物理作用裂解细胞，但在不同属的供试菌株DNA 提取中均取得了较好的提取效果.与之相似，李淼等［18］采用煮沸法成功提取了冻土中144 株细菌的总DNA.在大量菌株的分离鉴定过程中，采用本研究中的操作流程获取的PCR 产物可直接用于测序和克隆，在实现菌种保藏的同时，又缩减了DNA 提取的成本和时间，且减少了有机废弃物对环境的污染，提高了细菌菌株遗传信息的获取效率.

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