PCR-DGGE法解析牛粪厌氧发酵稳定期微生物多样性

夏吉庆，马添翼，郑国香，王忠江，康德福，王丽丽

（东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030）

随着全球新能源开发利用的深入，大力推进生物质能源的转化研究尤为重要，厌氧发酵便是其中之一。国内对于厌氧发酵中活性污泥微生物的多样性研究处于起步阶段，目前没有有效方法进行试验研究[1]。活性污泥微生物种类极其丰富，优势种群及其微生物多样性在活性污泥生态系统中发挥重要作用。因此对厌氧发酵中活性污泥进行研究分析，具有实际意义。因为采用厌氧发酵处理牛粪解决环境污染与提供生物质能源方法较少。本研究在开展牛粪两阶段厌氧发酵的基础上，采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术对通过溢流输送的发酵系统并带有在线活性污泥和发酵后沼液混合回流的工艺达到稳定运行系统中的微生物菌群进行分析，探讨菌群的生长特性，为完善厌氧发酵系统提供参考。

DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷，可以再现未被培养的微生物信息[2]，解决传统方法片面性等优点。DGGE技术在分析环境微生物群落多样性和动态性方面迅速得到应用。目前证实DGGE技术在揭示自然界微生物区系的种群差异和遗传多样性等方面具有优越性。该技术已经成为微生物群落动态和多样性分析的有力工具之一[3-9]。

1 试验设计

1.1 试验工艺

本试验以牛粪为发酵原料，对实验室的厌氧发酵设备进行相应的改造。可实现从酸化罐到一级产气罐、二级产气罐及后沉池或后储罐系统中的活性污泥沼液回流和溢流的两阶段（酸化阶段和产气阶段独立设置）的新型两步序批式产气溢流发酵系统。如图1所示，料液首先从上部进入酸化罐，由下部流出。再由一级产气罐的上部进入，由其下部流出。经过二级产气罐时是由其下部进入从上部流出，最后由上部进入后储罐，主要是利用压强差实现料液的溢流。

图1 两相厌氧溢流发酵系统装置Fig.1 Apparatusfor two-phaseoverflow anaerobic fermentation

此系统的特点是大量减少了泵和阀的使用从而能够降低故障的发生率。发酵系统可以将二级产气罐和后储罐中的活性污泥通过回流泵按一定比例回流到一级产气罐的进口处与酸化料液进行混合，从而使酸化料液迅速进入产甲烷气阶段。一级产气罐和二级产气罐还可以通过回流泵和阀门的控制实现各自本身的料液循环进行液体的自身循环搅拌功能。

本系统通过对系统中的生态因子（温度、PH值、进料频率等）进行控制，以系统产气率以及产气甲烷含量等为目标函数得出最佳污泥回流比、水力停留时间和物料浓度，当系统达到稳定运行状态时从系统中采集发酵料液进行菌群生长特性及其动态特性规律的研究和分析。

1.2 试验原料及其工艺性状

试验原料为沼液，取自牛粪两相厌氧发酵试验系统的稳定产气阶段，研究对象为菌群。该发酵系统容积为12 m3，中温30～35℃发酵，pH值为7.10～7.22，日产气量为15.6～18.8 m3。

使用PHG-1101型PH/ORP计和SURE1011气体涡轮流量计记录的试验原料的工艺性状如图2所示。

图2 试验材料的理化性质Fig.2 Physicochemical propertiesof Experimental material

1.3 仪器

试验过程中所用主要试验仪器为DGGE（美国伯乐），PHG-1101型PH/ORP计（武汉优测仪表有限公司），SURE1011气体涡轮流量计（天津市讯尔仪表有限公司）。

2 方法

2.1 样品的处理

为使试验样品不受其他菌体的影响，取样回来后立即放入通风处，待变至室温时再使用，用完后放入冰箱保持0℃不结冰。

2.2 DNA的提取

取牛粪厌氧发酵罐中微生物稳定期的发酵液作为样品。为保证条件的均一稳定，将取好的样品置于5 mL离心管中，4℃保存，最后统一进行基因组DNA提取。

采用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式粪便DNA提取试剂盒进行样品基因组DNA的提取（具体步骤详见试剂盒说明书）。采用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其提取效果。结果表明条带清晰明亮，DNA提取效果良好。

2.3 PCR扩增

采用引物为1401R GC（5'CGGTGTGTACAA GACCC3'）和968F（5'AACGCGAAGAACCTTAC 3'）对样品进行PCR扩增。

3 结果与分析

3.1 PCR图谱

采用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果，如图3所示。

图3 扩增效果Fig.3 Graph of expanded results

3.2 样品PCR扩增产物的DGGE电泳图谱

结果见图4。

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统将PCR扩增后的DNA进行DGGE电泳。电泳结束后进行银染，染色后的凝胶用透射扫描仪扫描，获取的凝胶谱图如图4所示。

由图4可知，牛粪两相厌氧发酵的活性污泥中的样品的PCR产物经DGGE分离出了数目、强度以及迁移位置都不同的条带。而这些不同位置的条带代表不同的细菌种群：电泳条带越多，细菌种群越多；条带信号越强，该条带代表的相应细菌数量也越多[11]。由图4可看出活性污泥中细菌种群较多，优势种群明显。根据DGGE图谱4可以看出，体系微生物群落的变化呈现出以下几方面特点：降解开始时的图谱条带较多，但强度稍弱。随着降解过程的不断进行，部分微生物种群逐渐减少，甚至消失，如Band-3，Band-15；有的微生物种群在降解过程中出现波动降解的过程：降解初期数量较少，而进入降解中期数量开始逐渐增多，最后降解末期又逐渐减少，如Band-6，Band-7；此外还有一些微生物种群的数量在降解过程中一直较少，直至降解末期才开始逐渐增多，如Band-2。

图4 DGGE电泳图谱Fig.4 DGGEelectrophorogram

3.3 DGGE图谱条带的序列比对结果

将DGGE图谱上的条带经胶回收后进行连接转化，同时将得到的菌液送上海生工测序。测序结果经Blast程序与GenBank数据库中序列进行局部同源性比较，比对结果如表2所示。大多数条带的16srDNA序列比对结果与数据库中序列的相似度超过95%，由此可以确定试验结果中这些条带代表的微生物与数据库中最相近的微生物属于同一个属。

表2 DGGE图谱中不同条带的序列比对结果Table 2 Sequence alignment analysis of DGGE spectrums bands

Verrucomicrobia疣微菌门是一门被划出不久的细菌。包括少数几个被识别的种类，主要被发现于淡水、海水和土壤环境、人类粪便中，或者城市固体垃圾填埋渗滤液产甲烷反应堆体系中。还有很多未被成功培养的种类是和真核宿主共生的，包括一些原核生物的外共生菌和线虫动物配子中的内共生菌。这种菌生长在极端的厌氧的条件下，将甲烷作为其唯一的能量来源。是一种新型的甲烷氧化菌。Chloroflexi绿弯菌门是在污水处理过程中丰富的生物脱氮除磷菌。经常在上流式厌氧污泥床处理高浓度有机废水中及活性污泥污水处理厂中被发现。Chloroflexi成员在处理城市污水的MBR的生态中可以降低膜污染的存在。Acetivibrio sp.多分离于垃圾污泥和猪粪中。成对或链排列，运动，中温生长，最适生长温度是35℃，化能有机营养，发酵碳水化合物产生乙酸，其他可能的产物有乙醇、CO2和H2，但不产生丙酸和乳酸。解纤维醋弧菌(Acetivibriocellulolyticus)对于发酵液中的不良环境有较好的耐受和调节能力，对挥发酸的生成起着重要作用。Lentisphaerae是黏胶球形菌门。Deltaproteobacteria出菇体形成的粘细菌在不利的环境释放myxospores，并严格厌氧属，其中包含大部分已知的一个分支硫酸盐（脱硫，Desulfobacter，Desulfococcus，Desulfonema等）和硫还原菌（如Desulfuromonas SPP）。以及其他几个具有不同的生理厌氧细菌。

从表3可以看出，微生物种类繁多，而且涉及黏胶球形菌门、β-变形菌纲、疣微菌纲等多个菌纲，同时也说明了微生物群落组成的多样性。

4 结论

a.利用分子生物学技术PCR-DGGE分析了两相厌氧溢流发酵工艺稳定期时的菌群结构，结果表明，具有溢流输送发酵系统并结合在线活性污泥和发酵后沼液混合回流的反应系统可以稳定可靠的运行。

b.DGGE图谱显示，活性污泥微生物稳定期细菌种群较丰富，优势种群明显，群落结构稳定。

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