特异性卵黄抗体对小鼠败血症及内毒素血症的保护作用相关研究

杨熙

1 败血症概述

败血症是由于致病菌或条件致病菌侵入血液，不断增殖并产生毒素所引起的临床综合征，主要表现为寒战、高热、白细胞增加等全身中毒症状，严重时可见感染性休克、弥散性血管内凝血(DIC)、中毒性脑病、心肌炎等。

细菌的入侵是引发败血症的主要原因。而大肠埃希氏杆菌败血症比其他致病菌感染引起的败血症更难治愈，常并合中毒性休克和DIC。抗菌药是临床治疗败血症的重要和有效手段。但近年来由于广谱抗生素不合理使用，各种耐药菌株相继产生，许多致病菌对一般的抗生素已经不敏感。为增强治疗效果，不得不加大抗菌药物的使用剂量，随之而来是耐药性的问题和药物引发的毒性反应。另外，抗菌药虽能一定程度的抑制或杀灭大肠埃希氏杆菌，但对其产生的内毒素不仅没有明显的抑制作用，还有资料表明抗生素可诱导内毒素的释放，而内毒素正是引发高热、寒战等中毒症状的重要因素。

2 内毒素及内毒素血症的概述

内毒素(Et)为革兰氏阴性菌体表面的一种小分子量的脂多糖(LPS)，是G-细菌胞壁膜层的主要成分，由亲水性的多糖、疏水性的类脂A(Lipid A)构成，位于内毒素最外层的0-特异性多糖决定了内毒素的不同菌型具有种属特异性，其核心多糖和Lipid A(统称为核心糖脂，CGL)是LPS结构中最稳定的部分，无种属特异性，其中Lipid A是LPS的主要生物活性和毒性成分［1］。

内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起。分为内源性和外源性两大类。

目前对内毒素血症的治疗尚缺乏成熟的经验。主动免疫是现代医学治疗主要采用的方法之一，内毒素核心糖脂疫苗具有生产成本低、可诱导宿主产生高效价内源性抗体等优点，能够在全身性内毒素释放之前或释放过程中，刺激机体产生抗体，并在脓毒症的最初期对机体起防护作用。脱毒LPS疫苗在实验动物中已显示出高度的免疫原性和良好的耐受性，其产生的多克隆抗体可结合到一些G-杆菌的LPS核心区，保护动物免于致死量内毒素攻击和G-细菌的侵袭性感染［2］。抗内毒素特异性抗体也应用于临床内毒素血症的治疗，其中，多克隆抗体Rc型的大肠杆菌J5抗血清已被试用于临床，但对G-细菌脓毒症的治疗效果并不理想;单克隆抗体:目前仅有2株-即E5与HA.1A已完成败血症治疗的临床应用研究，但效果不佳。LPS在体内的作用依赖于LBP的存在。LPS进入血循环后与内毒素结合蛋白(LBP)结合。LBP存在于正常血清中，在感染的急性相反应中其浓度增高100倍。完整的细菌膜上的LPS与LBP结合后将增强嗜中性粒细胞、单核巨噬细胞对它的调理和清除游离的LPS与LBP结合后形成LPS-LBP复合物，它的受体是巨噬细胞的分化抗原CD14分子，在与受体结合后将进一步传递细胞内信号而将炎症放大。这些LPS作用的经路也正是其可能的阻断点。而当代生物技术如细胞工程、基因工程都为此提供了可能性。实验发现预防性给予抗LBP抗体能保护小剂量内毒素的损害，但不能改善大剂量内毒素造成的损伤。

3 多器官功能失常(MODS)

MODS是指机体在受到严重创伤、休克、感染、大面积烧伤等急性损害24 h后，同时或序贯出现2个或2个以上的系统或器官功能障碍或衰竭，即急性损伤患者多个器官功能改变不能维持内环境稳定的临床综合征，临床上以感染性病因最为多见。感染性MODS更多的是由革兰阴性菌感染，造成内毒素血症或内毒素休克，由此引发机体一系列病理变化，如凝血功能障碍，机体代谢紊乱，微循环障碍等。DIC是感染性MODS病理变化中的一个重要组成部分。

许多MODS患者有腹腔化脓性感染或其他严重感染，其中尤以革兰阴性菌感染为主。革兰阴性菌内毒素以结构命名也称脂多糖(LPS)，是MODS的主要病因之一。

4 卵黄抗体及其应用

卵黄免疫球蛋白(IgY)99%以上存在于蛋黄中，统称为卵黄抗体。目前研究较多的是鸡蛋黄抗体。在鸡所产蛋的蛋黄中富含大量来源于血清的免疫球蛋白抗体IgG。鸡在受抗原刺激后7～10 d，其蛋黄中就有抗体产生，大约在20 d到达高峰。且其含里远高于血清。然后逐步下降。再次抗原刺激又会产生一个新的高峰一只鸡可获高特异性的免疫球蛋白抗体IgG长达28周。

IgY抗体与IgG抗体比较类似，但它们在结构上还是有一些明显的区别，见图1.1。IgY的分子量约180 kDa，由两条轻链和两条重链组成(2 h+2L)，其中轻链(L)分子量约22 kDa，重链分子量约67 kDa，等电点接近5.2。而哺乳动物IgG的重链分子量约50kDa，IgY更大的分子量是由于重链上恒定结构域和糖链的增加。并且，与哺乳动的IgG相比，IgY的铰链区的弹性更小。IgY结构虽然和IgG不同，但它仍具有免疫活性，且抗体活性很高。IgY的性质较稳定，活性保持良好。

图1 IgY和IgG的分子结构比较

低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性，高于80℃，大部分IgY丧失结合活性。此外IgY的酸碱稳定性较好，在pH＜4时，有部分IgY失活，pH为4～12，活性几乎不受影响，在pH＞12时迅速失活。并且IgY对胃蛋白酶有较好的抵抗力，但是对胰蛋白酶十分敏感［3］。

表1 IgY和IgG稳定性的比较

研究发现，经用特定的抗原免疫产蛋母鸡后，母鸡可产生对抗原的持久性应答，抗体在卵黄中出现的时候较在血清中出现晚一周左右，但蛋黄中的抗体含量超过血清，从蛋黄中可不断的获得特异性的多克隆抗体，由于其抗体来自同一个体，在抗体的均一性上，类似于单克隆抗体，这就克服了多克隆抗体大量制备的限制因素。

IgY不与金黄色葡萄球菌A蛋白结合，不与类风湿因子发生非特异性反应，对哺乳动物补体无固定作用，因而在检测诊断中特异性强，灵敏度高。

目前，利用特异性卵黄免疫球蛋白作为被动免疫性药物防治人畜病毒和细菌性疾病有很多成功的例子［4］。国内外大量文献证明，卵黄抗体(IgY)作为一大类药物具有重大的实用价值和良好的应用前景。

5 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体原理

为了生产鸡的特异性IgY用于免疫学检测，须检测卵黄中特异性IgY的效价。通常采用间接ELISA测定抗血清、抗体效价。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

图2 间接法ELISA示意图

本实验中主要采用间接法，测定IgY抗体的效价。其原理为利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法，如图2所示。

操作步骤如下:1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2)加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4)加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性［5］。

研究特异性抗体对大肠杆菌引起的小鼠败血症及内毒素血症的保护作用，对IgY的临床应用奠定基础，以寻找治疗败血症及内毒素血症的抗生素替代品具有重大的意义。

［1］常山，查晓霞，严小虎.内毒素血症的抗体治疗进展.西南国防医药，2004，14(3):330-332.

［2］麻丽，刘友生.抗内毒素治疗的研究现状.中华烧伤杂志，2003，19(3):190-192.

［3］王炯.鸡卵抗体(IgY)理化特性的研究.中国生物制品学杂志，1997，10(3):140-143.

［4］王宇，甄宇红，郭洁.抗奶牛乳腺炎特异性卵黄抗体的制备及活性检测.辽宁师范大学学报，2006，29增刊:90-91.

［5］蒋成淦.酶联免疫吸附测定法.北京人民卫生出版社，1984:102.