肠球菌esp基因与万古霉素耐药的相关性研究

王国富 吴利先 薛士鹏

肠球菌长期以来被认为致病力较低而未引起重视，但近年来，肠球菌属条件致病菌所致感染的发生率持续升高，尤其在原有严重基础疾病及机体免疫力降低时，极易侵入体内或易位，导致局部或全身重症感染，给临床治疗带来困难。目前，肠球菌已成为医院感染的主要致病菌，又容易形成生物被膜，临床上细菌生物被膜可形成于各种生物置入材料表面及体内黏膜表面，具有极强的耐药性及免疫逃避性，是造成临床慢性感染的主要原因之一。肠球菌表面蛋白(enterococca surface protein，ESP)是由esp基因所编码的。与肠球菌生物被膜的形成及免疫逃逸有关［1］，而生物被膜的形成及免疫逃逸是细菌耐药株出现和传播的必要风险因子［2］。因此，了解esp基因在肠球菌在临床的流行情况，分析esp基因的存在状况与肠球菌之间耐药的相关性就显得非常必要。对此本研究对从医院重症监护病房(intensive care unit，ICU)感染患者分离得到的94株肠球菌进行esp基因与万古霉素耐药的相关性研究，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床菌株 94株肠球菌来自医院7个ICU病房患者的临床标本［3］。药敏试验的质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC2592和粪肠球菌ATCC29212为本室保存。

1.2 试剂材料 万古霉素和替考拉林标准品购自美国礼来公司。地高辛标记的探针检测试剂盒购自美国罗氏公司。用于屎肠球菌和粪肠球菌esp基因扩增的2对引物［4，5］由上海生工合成。屎肠球菌esp基因的引物，P1:5’-TTGCTAAT-GCAGTCCACGA CC-3’和 P2:5’-GCGTCAACACTIGCATTGCCGA-3’;粪肠球菌esp基因的引物P1:5’-GTGTGGGTGTTGCATCAGTATT-3’和 P2:5’-CATACTGGGCCAATC GTTCATC-3’。

1.3 方法

1.3.1 菌株对万古霉素和替考拉林MIC测定和耐药性判定按照NCCLS推荐的标准方法，测定94株菌对万古霉素和替考拉林的MIC值，按照NCCLS标准对耐药性进行判断。

1.3.2 肠球菌esp基因分布的检测 使用参照文献［6］的高特异性菌落杂交法。具体步骤为将尼龙膜剪切后放置于培养肠球菌的BHI平板表面，然后用96孔接种器将增菌培养后的肠球菌接种于尼龙膜表面培养过夜。用溶菌酶、NaOH、氯仿和乙醇处理，使细菌DNA结合于膜表面，并置于4℃的冰箱保存备用。用合成的引物进行PCR扩增，将扩增产物纯化并测序，保证获得正确的序列。采用地高辛标记试剂盒提供的方法标记探针，获得检测esp基因的探针，按试剂盒说明进行杂交和检测，并统计结果。

2 结果

2.1 94株肠球菌对万古霉素和替考拉林的耐药性 屎肠球菌和粪肠球菌对万古霉素和替考拉林的耐药率检测结果见表1。屎肠球菌的耐药率明显高于粪肠球菌对万古霉素和替考拉林的耐药率。

表1 粪肠球菌与屎肠球菌对万古霉素和替考拉林的抗菌敏感性比较(例，%)

2.2 esp基因的分布与万古霉素耐药的相关性 试验对94株肠球菌(其中粪肠球菌63株，屎肠球菌31株)的esp基因进行了检测，结果显示63株粪肠球菌中有24株(38.1%)esp基因为阳性。结合耐药检测结果发现所有对万古霉素和替考拉林耐药和中介菌株esp基因均为阳性。而31株屎肠球菌中有13株(41.9%)esp基因为阳性。结合耐药检测结果发现这13株中同样包括了对万古霉素和替考拉林耐药和中介的屎肠球菌菌株。结果见表2和表3。

表2 esp基因在细菌中的分布(例，%)

表3 esp基因与万古霉素耐药相关性比较

3 讨论

近年来，临床上多重耐药G+菌感染的形势越来越严重，其中肠球菌(Enterococcus)是主要的病原菌之一，其感染已成为医院内感染病原菌的第2位。随着对肠球菌致病机制的逐步深入，发现肠球菌与多种置入医疗器材如导尿管、静脉插管和人工瓣膜所引起的生物被膜相关感染有关，而esp基因编码的ESP蛋白在肠球菌生物被膜形成中起了重要的作用。万古霉素一度被认为是临床抗感染的最后一道防线，但目前各个国家和地区均有报道出现了耐万古霉素的肠球菌菌株，成了临床治疗的一大难题。为了解本地区肠球菌的耐药趋势以及esp基因与万古霉素耐药的相关性，本研究将ICU分离到的94株肠球菌进行了万古霉素和替考拉的耐药性检测。结果在粪肠球菌中检出4株(6.35%)替考拉林耐药菌株;检出3株(4.76%)万古霉素耐药菌株，而屎肠球菌检出5株(16.1%)替考拉林耐药菌株，万古霉素耐药菌株7株(22.58%)，粪肠球菌耐药率明显低于屎肠球菌对替考拉林和万古霉素的耐药率，这一结果比其他医院报道的结果要高［7］。主要的原因可能是本研究检测的细菌是来自重症监护病房，这里的患者一般均有基础疾病，需要长期使用抗生素所至。

本研究还对同批94株肠球菌进行了esp基因检测，实验结果显示63株粪肠球菌中有24株菌的esp基因为阳性。31株屎肠球菌中13株菌esp基因阳性，比国外报道相对要低。在所有对万古霉素和替考拉林耐药和中介的粪肠球菌和屎肠球菌esp基因均为阳性。这说明esp基因分布与肠球菌对万古霉素耐药的关系非常密切。这可能与Esp蛋白有独特的基因结构，可以改变蛋白表达形式，而这种细胞壁表面的结构发生变化，使肠球菌能避过免疫宿主的阻挡，在强大的抗菌药物选择性压力下继续生存，而且阳性株耐药的esp比阴性株esp更易传播。两外还与esp基因与细菌生物被膜形成有关。在生物被膜的保护下，细菌可以相互交流，协同生长，形成细菌微环境，而不易被杀灭［8］。生物被膜的产生使生物被膜内细菌对抗生素的耐药性比浮游细菌增加了10～1000倍，更能够抵抗机体的免疫效应和抗生素的杀菌作用。由此得出肠球菌esp基因的存在与细菌耐万古霉素密切相关，从而esp基因的存在就为肠球菌耐药性监测提供了一个有用的分子标志物，有助于将Esp蛋白作为临床抗肠球菌属治疗的一个新靶位，达到控制肠球菌感染和耐药逐渐上升的目的。

［1］Toledo-Arana A，Valle J，Solano C，et a1.The Enterococcus surface protein，ESP，is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation.Appl Environ Microbiol，2001，67(10):4538-4545.

［2］Coque TM，Willems R，Canton R，et a1.High occurrence of esp among ampicillin-resistant and vancomycin-susceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients.J Antimicrob Chemother，2002，50(8):1035-1038.

［3］吴利先，王国富，郑行萍.重症监护病房的肠球菌种类及其耐药性分析.大理学院学报，2007，6(10):28-30.

［4］Van Wamel WJ，Hendrickx AP，Bonten MJ，et a1.Growth condition-dependent Esp expression by Enterococcus faecium affects initial adherence and biofilm formation .Infect Immun，2007，75(2):924-931.

［5］Shankar N，Lockatell C V，Baghdayan A S，et a1.Role of Enterococcus faecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection.Infect Immune，2001，69(7):4366-4372.

［6］王国富，吴利先，薛士鹏.ICU肠球菌属esp基因分布及对万古霉素耐药的相关性研究.中华医院感染学杂志，2012，22(13):2724-2726.

［7］王德，苏琪，王丽.184株肠球菌的临床分布及耐药性分析.中国抗生素杂志，2010，35(2):160，S1-S3.

［8］周索兰，鲍亚泽，洪霞，等.医院内尿路感染病原菌的监测及耐药性分析.中华医院感染学杂志，2007，17(12):1590-1593.