Cry8Ga1蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫主要酶活性的影响

谭树乾， 尹 姣， 李克斌， 束长龙，刘春琴， 曹雅忠＊， 仵均祥

（1.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学应用昆虫学重点实验室，杨凌 712100；2.中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.沧州市农林科学院，沧州 061001）

Cry8Ga1蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫主要酶活性的影响

谭树乾1，2， 尹 姣2， 李克斌2， 束长龙2，刘春琴3， 曹雅忠2＊， 仵均祥1＊

（1.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，西北农林科技大学应用昆虫学重点实验室，杨凌 712100；2.中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；3.沧州市农林科学院，沧州 061001）

华北大黑鳃金龟［Holotrichiaoblita（Faldermann）］是一种危害严重的地下害虫，Cry8Ga1蛋白对其幼虫具有明显杀虫活性。本文比较了华北大黑鳃金龟幼虫取食Cry8Ga1蛋白后6种酶活性的变化，发现取食高浓度（5×LC50，50.767μg／g土）Cry8Ga1蛋白幼虫的总蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽－S－转移酶（GST）以及氨肽酶（APN）的活性较对照均有不同程度的升高，在大多数处理时段差异显著（P＜0.05），其中高浓度处理组的GST酶活性在12h后升高倍数最大，是同时段对照的23.37倍；而取食低浓度（0.5×LC50，5.076 7μg／g土）Cry8Ga1蛋白时，乙酰胆碱酯酶和氨肽酶活性无明显差异（P≥0.05）。类胰蛋白酶在整个试验中活性变化与对照相比仅有个别处理时段存在差异，由此推断，类胰蛋白酶不是华北大黑鳃金龟幼虫对Cry8Ga1蛋白的主要活化酶。关键词 大黑鳃金龟； Bt； Cry8Ga1； 酶活性

华北大黑鳃金龟［Holotrichiaoblita（Faldermann）］属鞘翅目（Coleoptera）金龟总科（Scarabaeoidea），是我国华北、黄淮海和东北等地区地下害虫的优势种之一，其幼虫（蛴螬）主要为害小麦、花生、大豆、玉米、高粱、马铃薯等，发生危害严重［1］。大黑鳃金龟因栖息在土壤中，隐蔽危害，加之生活世代长，因而难以测报和防治。

目前对蛴螬防治主要依靠化学农药，而化学农药对农产品和环境污染严重［2］。苏云金芽胞杆菌（BacillusthuringiensisBerliner，Bt）能在土壤中自然生长繁殖，不污染环境，对人畜无害。对金龟子科害虫具有杀虫作用的cry类基因的发现和克隆，为此类害虫的防治提供了一种新型的绿色途径。Ohba等1992年首次筛选出对金龟子幼虫具有高效杀虫活性的Bt菌株之后［3］，国内外对蛴螬有杀虫活性的Bt菌株的研究和报道便屡见不鲜［4－7］。

经典的Cry蛋白杀虫机理主要分为四步：晶体蛋白在敏感昆虫中肠内溶解；中肠蛋白酶对原毒素进行消化，并释放出活性多肽；活性多肽与中肠膜受体结合；活性多肽插入中肠细胞表皮膜形成离子通道或孔道，打破中肠肠道细胞的渗透平衡，细胞病变，导致昆虫死亡［8］。其中昆虫取食Bt蛋白后一些解毒酶和蛋白酶的活性变化是影响Bt毒性的重要因素。目前，国内外的这类研究以鳞翅目居多，鞘翅目害虫很少见。本研究主要对华北大黑鳃金龟幼虫取食Cry8Ga1蛋白后体内相关酶活性进行测定，以探索Cry8Ga1蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫酶活性的影响，为Cry8Ga1蛋白应用于蛴螬的防治研究以及Bt杀虫作用机理的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫

虫源由河北省沧州市农林科学院提供。田间捕捉华北大黑鳃金龟成虫，在室内用榆树叶饲养至产卵，将卵放入塑料盒内孵化。选5～7日龄幼虫进行试验处理。

1.1.2 供试Bt蛋白

携带Cry8Ga1蛋白的菌株HD8Ga由中国农业科学院植物保护研究所生物技术组提供。

菌株接入牛肉膏液体培养基，30℃培养至芽胞释放。12 000r／min离心15min，用少量无菌水悬浮沉淀，制成晶胞悬液，测定其Cry8Ga1蛋白含量。液氮冷冻后－80℃保存。参照Shu Changlong发表的Cry8Ga1蛋白对大黑鳃金龟的 LC50（10.153 4μg／g土）［9］，将晶胞悬液稀释成0.5×LC50和5×LC50两个浓度，待用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

用浓度为0.5×LC50和5×LC50的晶胞悬液浸泡干燥的马铃薯丝20min后，再将称好的灭菌土倒入其中与其拌匀作为饲料，以无菌水拌土作对照。土与晶胞悬液或水的质量比为5∶1，土与马铃薯丝的质量比为23∶1。用制备的饲料饲喂6孔板中饥饿处理6h的5～7日龄华北大黑鳃金龟幼虫，28℃环境饲养。饲喂处理12、24、36、48、60、72h后取样，每次取3头幼虫，经液氮冷冻后－80℃保存。试验重复3次。将冷冻保存的华北大黑鳃金龟幼虫放入玻璃匀浆器中，加1mL预冷的0.15mol／L NaCl溶液，冰上匀浆。匀浆液4℃、12 000r／min离心20min，取上清液作为酶液，备用。

1.2.2 酶活性测定

总蛋白酶的活性测定参照王琛柱等的方法［10］，将偶氮酪蛋白（azocasein）用0.15mol／L的 NaCl溶液溶解成2mg／mL。将10μL酶液、100μL偶氮酪蛋白溶液和40μL 50mmol／L的甘氨酸－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）混合，于30℃反应3h，然后加入70μL预冷的10%（质量／体积）三氯乙酸终止反应，反应混合物在4℃、12 000g下离心20min，取60μL上清液和40μL 1mmol／L的NaOH溶液混合，在410nm测吸光值。

类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶以及氨肽酶的活性测定参照魏纪珍等的方法［11］。其中类胰蛋白酶活性测定略作修改，以BAPNA作为底物，用二甲基亚砜（DMSO）将底物溶解成1mmol／mL。将40μL酶液、80μL底物和40μL 50mmol／L甘氨酸－氢氧化钠（pH 10.0）缓冲液加入酶标板中，410nm处读取吸光值，每15s读一次，持续30min。

乙酰胆碱酯酶的活性测定参照张炬红等的方法［12］。

谷胱甘肽转移酶活性测定参照Habig的方法［13］，用乙醇将 CDNB 溶解成 1.2mmol／L 的溶液，用0.1mol／L、pH 为7.6的磷酸缓冲液（PBS）将GSH溶解成6mmol／L的溶液。将80μL的PBS、20μL酶液、100μL的CDNB和100μL的GSH溶液加入96孔酶标板中，在340nm下读取吸光值，每15s读一次，持续15min。

1.2.3 可溶性总蛋白测定

以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，参照Bradford方法测定，每样品重复3次。

1.3 数据处理

用SPSS 17.0分析软件进行数据的统计学分析，采用Duncan法和t测验方法对不同处理进行差异性检验。

2 结果与分析

2.1 总蛋白酶

测试结果（图1）表明，5×LC50（高浓度）处理的华北大黑鳃金龟幼虫体内总蛋白酶活性在12、36、48、60h和72h，与对照相应时段相比显著升高（P＜0.05），并在12h上升幅度最大，与对照相比上升6.77倍。0.5×LC50（低浓度）处理除48h的存在显著差异（P＜0.05）之外其余时间段的与对照间差异不显著（P≥0.05），但也较对照上升。两个浓度处理组之间变化趋势基本相同，但高浓度处理组总蛋白酶活性在各处理时段均高于低浓度处理组，除24、60h和72h处理时段之外在其他5个相应处理时段间存在显著差异（P＜0.05）；48h之前总体上升，并都在48h达到最高，随后下降。

图1 大黑鳃金龟幼虫总蛋白酶活性的变化Fig.1 The activity changes of total protease

2.2 类胰凝乳蛋白酶

从图2可以看出，5×LC50处理的华北大黑鳃金龟幼虫类胰凝乳蛋白酶活性在12、36、48h和60h，与对照相比显著升高（P＜0.05），在48h达到最高点。12h时比对照提高9.99倍，在各处理时段中最高。0.5×LC50处理一直上升，并在48h后与对照有显著差异（P＜0.05）。两浓度处理组间除24h和72h处理时段之外均有显著差异（P＜0.05）。

图2 大黑鳃金龟幼虫类胰凝乳蛋白酶活性的变化Fig.2 The activity changes of chymotrypsin－like

2.3 类胰蛋白酶

如图3所示，5×LC50浓度处理的华北大黑鳃金龟幼虫类胰蛋白酶活性在12h达到最高点，与对照相比显著升高（P＜0.05），然后明显下降，36h时开始缓慢上升（无显著差异P≥0.05），到60h时类胰蛋白酶活性出现第2次小高峰，并与对照相比存在显著差异（P＜0.05）；随后再次下降。而0.5×LC50（低浓度）处理与高浓度（5×LC50）处理明显不同，类胰蛋白酶活性仅在48h时出现一个高峰，并与对照和高浓度（5×LC50）处理间差异显著（P＜0.05）；其他处理时段均与对照相似（P≥0.05）。

图3 大黑鳃金龟幼虫类胰蛋白酶活性的变化Fig.3 The activity changes of trypsin－like

2.4 谷胱甘肽－S－转移酶

处理后的虫体谷胱甘肽－S－转移酶（GST）活性均高于对照（见图4）。5×LC50处理的大黑鳃金龟幼虫GST活性在不同处理时段变化较大；其中，在12h时活性较高，到24h时明显下降，在36h时有所上升，在48h时达到最高，随后再迅速下降；但始终显著高于对照（P＜0.05）其中12h与对照相差倍数最大，是对照的23.37倍。而高浓度（0.5×LC50）处理幼虫的GST活性除在24h和72h之外，其余时间明显高于0.5×LC50处理（P＜0.05）。0.5×LC50处理与对照无显著差异，趋势平稳。

图4 大黑鳃金龟幼虫谷胱甘肽－S－转移酶活性的变化Fig.4 The activity changes of GST in Holotrichiaoblitalarvae

2.5 乙酰胆碱酯酶

测试结果（图5）显示，经饲喂Cry8Ga1蛋白的混合饲料高浓度（5×LC50）处理后，华北大黑鳃金龟幼虫体内乙酰胆碱酯酶（AChE）活性与对照相比处于升高水平，除24、36h和72h外，其他处理时段幼虫的乙酰胆碱酯酶活性均显著高于对照（P＜0.05），其中在48h处理时段AChE的活性达到高峰，与对照相比提高了3.47倍。而低浓度（0.5×LC50）处理组幼虫的乙酰胆碱酯酶活性，虽然在48h后达到最高，但总体来看0.5×LC50的浓度处理与对照差异不显著（P≥0.05）。两浓度处理组之间AChE活性的变化趋势基本一致，但高浓度处理组在12、24、48h和60h处理时段均显著高于低浓度处理组（P＜0.05）。

图5 大黑鳃金龟幼虫乙酰胆碱酯酶活性的变化Fig.5 The activity changes of AShE

2.6 氨肽酶

华北大黑鳃金龟幼虫经两种浓度Cry8Ga1蛋白的混合饲料饲喂处理后，体内氨肽酶（APN）活性发生了不同程度的变化（图6）。高浓度（5×LC50）处理组幼虫的氨肽酶活性变化表现为升高－下降－再升高－再下降的趋势，其中在36h达到最高点；与对照相比，48h提高倍数最大，达到7.67倍；除24h和72h处理时段外，其他处理时段幼虫的氨肽酶活性与对照和低浓度（0.5×LC50）处理组相比均显著升高（P＜0.05）。而0.5×LC50（低浓度）处理组的变化较平稳，仅在48h出现一个高峰点，各处理时段APN的活性均与对照无显著差异（P≥0.05）。

图6 大黑鳃金龟幼虫氨肽酶活性的变化Fig.6 The activity changes of APN in

3 结论与讨论

通过对华北大黑鳃金龟幼虫饲喂Cry8Ga1蛋白两种浓度（5×LC50和0.5×LC50）混合食物，然后分不同时段测试其幼虫6种相关酶活性的结果表明，幼虫的总蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽－S－转移酶、氨肽酶以及类胰蛋白酶的活性比对照均有不同程度的升高；其中前5种酶的活性有明显上升，而类胰蛋白酶活性变化不够明显。总体来看，高浓度（5×LC50，50.767μg／g土）处理组幼虫的6种酶活性在72h范围内不同时段的变化，均表现为先升高（12h）—下降（24h）—再升高（48h或36h）—再下降的趋势；0.5×LC50（低浓度）处理组的6种酶活性变化平稳，与对照相比大多无显著差异。

在Cry蛋白对昆虫的作用中，只有被蛋白酶活化之后才能对昆虫有毒杀活性，昆虫中肠蛋白酶与Bt蛋白的毒性密切相关。Oppert等认为丝氨酸蛋白酶类是Bt蛋白的主要消化酶［14］。张少燕等对棉铃虫幼虫的研究也发现类胰凝乳蛋白酶的活性随Bt蛋白浓度增大而显著升高［15］。从本文结果中可以看出，取食Cry8Ga1蛋白使华北大黑鳃金龟幼虫总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性较对照上升，且其活性随处理浓度的增加而上升；无论是高浓度处理还是低浓度处理，幼虫类胰蛋白酶活性较对照变化均不够明显。由此可以推测，在华北大黑鳃金龟幼虫体内，对Cry8Ga1蛋白活化起主要作用的可能是总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶；总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的升高可以使更多的Cry8Ga1蛋白转化为毒性多肽，其毒性增加。

谷胱甘肽－S－转移酶和乙酰胆碱酯酶是昆虫体内重要的解毒酶。陆琼等研究发现Cry2Ab蛋白处理的小地老虎初孵幼虫谷胱甘肽－S－转移酶活性上升［16］。本文中华北大黑鳃金龟幼虫处理后谷胱甘肽转移酶活性上升趋势明显，并与取食Bt的Cry8Ga1蛋白浓度成正相关。宋健等对侵染Bt的铜绿丽金龟幼虫的乙酰胆碱酯酶酶活性测定，结果显示铜绿丽金龟乙酰胆碱酯酶活性上升［17］。本文中乙酰胆碱酯酶活性在低浓度处理时无明显变化，而高浓度处理组在3个时间段有显著上升。这些结果说明在取食Cry8Ga1蛋白的最初72h内，华北大黑鳃金龟幼虫的谷胱甘肽－S－转移酶和乙酰胆碱酯酶可能参与了对Cry8Ga1蛋白的解毒作用，华北大黑鳃金龟幼虫在开始受到Bt蛋白的不利刺激时有一定的自卫能力。然而，这个现象是否与Cry8Ga1蛋白对大黑鳃金龟毒杀效果缓慢有关，还需要进一步研究。

魏纪珍等在研究中发现，经Cry1Ac处理后棉铃虫蛋白酶活性变化主要表现在12h，Cry2Ab处理后其酶活力最高的变化出现在36h［11］，表明不同Cry蛋白在不同昆虫中肠中活化的时间有所不同。本试验中，Cry8Ga1处理华北大黑鳃金龟幼虫后，其总蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、类胰蛋白酶活性出现较大变化是在两个时间点，它们分别是12h和48h。作者推测，华北大黑鳃金龟幼虫从开始取食Cry8Ga1蛋白到其死亡之前，Cry8Ga1蛋白可能在多个时间点活化，即蛋白酶活性升高的峰值可能会多于一个。随着蛋白酶活性升高，被活化的Cry8Ga1蛋白增多，毒性增大，华北大黑鳃金龟幼虫解毒酶（乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽－S－转移酶）活性也在相应时间内升高。但其酶活性的动态机制尚需深入研究。

氨肽酶在昆虫体内不仅有消化蛋白的作用，在鳞翅目昆虫中还是一种重要的Bt受体。2000年Santos还发现其有信号转导的作用［18］。本试验中，氨肽酶在低浓度处理下变化不明显，而高浓度则明显升高。这说明，高浓度Cry8Ga1蛋白可诱使氨肽酶的活性升高。而氨肽酶的3种不同作用在Cry8Ga1蛋白对华北大黑鳃金龟幼虫毒杀过程中是怎样协调的，尚待明确。

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Effects of Cry8Ga1 toxin on the activities of main enzymes inHolotrichiaoblitalarvae

Tan Shuqian1，2， Yin Jiao2， Li Kebin2， Shu Changlong2， Liu Chunqin3， Cao Yazhong2， Wu Junxiang1
（1.StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas，KeyLaboratoryofAppliedEntomology，Northwest A＆FUniversity，Yangling712100，China；2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.CangzhouAcademyofAgriculturalandForestrySciences，Cangzhou061001，China）

Holotrichiaoblita，an underground insect pest，causes serious damages on crops in China.It is well known that Cry8Ga1 has a larvicidal activity againstH.oblita.In this study，the larvae ofH.oblitawas fed with two concentrations of Cry8Ga1.Subsequently，the activities of 6 enzymes were assayed.It was found that when only applied with higher concentration of Cry8Ga1（5×LC50，50.767μg／g soil），the activities of total protease，chymotrypsin－like enzyme，acetylcholinesterase （AChE），glutathione－S－transferase （GST）and aminopeptidase（APN）in larvae would significantly rise in most time of the experiment（P＜0.05）.And the GST activity after 12 h in higher－concentration group was 23.37 times as much as the control，which was the largest multiple of the elevatory enzymes activities.However，the differences of the activities of AChE and APN in larvae were insignificant between the lower concentration（0.5×LC50，5.076 7μg／g soil）group and control（P≥0.05）.The activities of the trypsin－like enzyme showed difference occasionally.It is therefore deduced that the elastase－like proteinases were not the main digestive enzymes of Cry8Ga1 in the larvae ofH.oblita.

Holotrichiaoblita； Bt； Cry8Ga1； enzyme activity

S 476

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2013.03.001

2012－11－09

2012－11－19

公益性行业（农业）科研专项（201003025）；国家自然科学基金（31000853）

＊ 通信作者曹雅忠，Tel：010－62815619，E－mail：yzcao＠ippcaas.cn；仵均祥，E－mail：junxw＠nwsuaf.edu.cn