非培养法检测肝硬化患者腹水真菌的实验研究

吴浩，兰兰

(武宁县人民医院检验科，江西 武宁332300)

肝硬化并发感染在临床上十分常见，而真菌感染的发病率呈上升趋势。由于肝硬化腹水患者库普弗细胞(Kupffer cell)数量明显减少，导致其不能发挥吞噬过滤作用[1]。同时血浆补体和调理素水平降低，低白蛋白血症，中性粒细胞Na+-K+-ATP酶活性降低，使中性粒细胞防御感染能力削弱[2]。另外，由于肝硬化时肠道菌群结构平衡被打破，肠道真菌数量和种类都可能发生改变，患者免疫防御系统遭破坏，念珠菌等肠道定植真菌很可能成为人体黏膜和侵袭性真菌感染的条件致病菌[3]。

目前国内外更多关注肝硬化患者腹腔的细菌感染，而研究真菌感染方面较少。本文以分子生物学为研究方法，根据真菌18S rRNA基因兼有保守性和变异性的特点，在保守区设计一对通用引物，通过PCR方法结合克隆测序法，检测肝硬化患者腹水中真菌感染情况。

1 材料与方法

1.1 病例选择 收集2010年3月至2011年3月我院158例肝硬化患者的腹水标本，每份腹水标本收集1次，男127例，女31例，年龄21~79岁，平均年龄(54.7±13.0)岁。肝硬化诊断符合2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准[4]。取受试者腹水，接种在沙保氏培养基上30℃培养3~7d，通过形态学检测结合法国生物梅里埃公司的Vitek YBC卡鉴定菌种。同时收集腹水分装于2 ml进口高压灭菌的 Eppendorf管中。所有标本均在1 h内处理完毕，并置于-80℃冰箱中待抽提 DNA[5]。

1.2 对照菌株 阳性对照真菌：白色念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌。阴性对照菌细菌：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌。 以上菌株由检验科微生物室提供。

1.3 DNA提取 对照菌株取3~5个菌落于200μl生理盐水中，其余步骤参照QIAampRDNA mini kit说明书，提取总DNA。

1.4 引物特异性检测 用真菌18S rDNA通用引物(5＇-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3＇)和(5＇-GATCCCTAGTCGGCATAGTT-3＇)[6，7]，PCR 扩增 8 种真菌对照菌株，2种细菌对照菌株DNA。扩增体系为25μl：10×Buffer(含 MgCl2)2.5μl，dNTP(各 2.5mmol/L)2.5μl,引物(10μmol/L)0.6μl，Taq 酶(5U/μl)0.2μl，模板 DNA2μl，反应条件：95℃预变性 4min，94℃变性 45s，52℃退火45s，72℃延伸 2min， 循环 38次，72℃ 7min完成扩增，取5μl PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行图像分析处理，以检测引物特异性。

1.5 PCR扩增真菌18S rDNA 采用上述引物、扩增体系、扩增条件对病人腹水中提取的DNA进行扩增。经琼脂糖电泳后，凝胶图像分析仪摄像。

1.6 真菌18S r DNA基因克隆、测序及同源性分析将PCR产物与pGEM-T easy vector连接，转化至DH50α 宿主细胞中。 使用含 16μl 20%IPTG、40μl l2%X-gal和1%氨苄西林的选择性LB琼脂平板筛选含重组质粒的白色克隆子，将白色克隆子点种两点于LB平板上，取一点进行PCR验证，PCR条件同上。对验证阳性的克隆子，取另一点经LB培养液培养后，进行测序。测得的DNA序列通过BLAST软件进行DNA序列相似性分析。

2 结果

2.1 对照菌株18S rDNA扩增结果 7种对照真菌菌株用真菌通用引物扩增在1000bp左右都有一条条带，而3种对照细菌菌株未能扩出相应条带，说明该引物扩增真菌18S rDNA具有很好的特异性，见图1。

图1 对照菌株18SrDNA扩增结果

2.2 受试者腹水DNA扩增、克隆、测序及BLAST结果 有11份腹水标本真菌18S rDNA扩增阳性，经克隆、测序后，测序结果用BLAST软件在NCBI GenBank DNA序列数据库进行比对，其中未能培养真菌(uncultured fungus)最多，占43.8%，念珠菌属(Candida spp.)占 9.4%,酵母菌属(Saccharomyces spp.)占3.1%，此外还有双足囊菌、马拉色菌、裸菇菌以及其他少见真菌等。

2.3 培养法与分子生物学法比较 有2份腹水标本真菌培养阳性，分别为S25—地丝菌和S26—近平滑念珠菌。PCR扩增18S rDNA,S25和S26均可在1000bp左右出现一条条带，经克隆、测序、BLAST比对后S25为双足囊菌，即头状地霉，而该菌属于地丝菌属，与培养结果一致。S26检测出近平滑念珠菌。

3 讨论

真菌广泛分布于自然界，在人体皮肤、黏膜、粪便中常可检测到，亦是肠道正常菌群。在维持肠道微生态中起着重要作用，通常并不致病。近年来，临床深部真菌感染增多且复杂，在国内外多有报道[8，9]。肝硬化病人因免疫力降低、长期服用广谱抗生素等 原因，致使体内微生态失衡，外源性真菌乘虚而入或内源性常驻真菌大量繁殖而致病。另外，肠道屏障的结构和功能改变引起肠道通透性增加，有利于肠腔内真菌易位到肠腔以外部位并引起侵袭性感染，肠道为系统性真菌病发生的源头[3]。

培养法是临床上检测真菌的主要方法，广泛应用于各临床实验室。其主要依据形态学和生理学等表型特征对真菌进行鉴定，往往费时且阳性率低[10]。由于技术的限制，目前能被分离培养而为人类了解的微生物仅是世界上微生物资源中极少的一部分，仅有5%的真菌能被分离培养和检测到[11。因此，建立一种检测真菌感染快速而准确的方法十分必要。

为了克服传统培养方法的局限性 ,分子生物学方法被用于真菌生态研究。据最新研究报道，18S rDNA和ITS的限制性片段分析是真菌群落分析和种类鉴定的快速有效方法[12]。18S rDNA序列包含保守区域和可变区域，普遍存在于真菌基因组中，是真菌多态性研究广泛采用的靶序列[13]。本文通过设计真菌18S rDNA通用引物,扩增真菌的18S rDNA,通过克隆测序鉴定真菌的种类。本研究证实，与传统的培养法比较，在培养阳性的两例腹水标本，PCR法同样检出了相应条带，并通过克隆测序，证实分子生物学法检出的真菌种类与培养法相符。另外，该方法还能检测到未能培养的真菌及其他一些培养无法鉴别的真菌，阳性率更高。因此，真菌通用引物扩增真菌DNA具有高度特异性、敏感性,且用分子生物学法可检出一些培养法无法培养的真菌。

本研究课题在158例肝硬化患者腹水中发现11例真菌DNA阳性，而对于腹水中真菌从何而来，目前还不得而知。很多研究表明了实验室应用PCR诊断传染病的有效性和实用性。目前，应用PCR法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA，已成为研究肝硬化患者肠道细菌易位的一种新方法，腹水中细菌DNA阳性可作为肝硬化患者肠道细菌易位至腹水的分子证据[14]。也许，应用分子生物学方法将为研究肝硬化病人腹水真菌来源提供新的方法和思路。

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