RNA干扰抗A型H1N1流感病毒的研究

李 洋 马程远 郭健杏 田明尧 金宁一 华树成

(吉林大学第一医院呼吸内科，吉林 长春 130021)

尽管传统的A型H1N1流感病毒不是当前的流行毒株，但是它可以持续不断地变异和重组，一旦A型H1N1流感病毒通过抗原漂移和抗原转换机制获得强致病能力，会对人类健康造成的巨大威胁。A型流感病毒基因组RNA在复制过程中高达10－4的错配率及机体免疫和药物治疗的选择压力，使病毒不断地变异与进化〔1〕，造成了流感流行与爆发。而现有的疫苗和药物不能有效控制该病毒感染。寻找一种新的抗流感病毒方法迫在眉睫。在病毒基因中往往越保守的序列就越重要，如果能封闭或抑制病毒基因的某些保守序列发挥功能，就可以抑制病毒基因的表达，抵抗病毒感染。

因此，本实验利用RNA干扰(RNAi)技术进行抗A型H1N1流感病毒的体外研究，选择在A型H1N1流感病毒复制过程中起重要作用的RNA聚合酶PA编码基因中的高度保守序列作为靶序列，观察诱导PA基因沉默情况，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备 A/NewCaledonia/20/99(H1N1)毒株及马丁-达比狗肾(MDCK)细胞由本室保存。各种限制性内切酶及荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)购自TaKaRa公司;T4连接酶、M-MLV反转录酶购自Promega公司;RNA提取试剂Trizol购自GIBCO公司;转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司;鼠源NP单抗由本室提供;辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG单抗、DAB为鼎国公司产品;pSilencer 5.1-U6表达性载体(Ambion)，ABI 7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司);荧光显微镜(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的设计合成及表达质粒的构建 根据siRNA的设计原则，以A型H1N1毒株PA基因为靶基因，选择其高度保守区，设计了特异性siRNA的DNA寡核苷酸序列，GC含量为30%～50%，BLAST分析使其不针对任何已知的其他基因，符合siRNA设计原则。由上海生工生物有限公司合成，序列如下:PA646:5'-GATCCGCTTCTCCTGCATTGAGAATTTCAAGAGA ATTCTCAATGCAGGAGAAGTTTTTTGGAAA-3'，5'-AGCTTTTCC AAAAAACTTCTCCTGCATTGAGAATTCTCTTGAAATTCTCAATG CAGGAGAAGCG-3'，PA841:5'-GATCCATTCCTGCTGATGGATTCTTTCAAGAGAAGAATCCATCAGCAGGAATTTTTTTGGAAA-3'，5'-AGCTTTTCCAAAAAAATTCCTGCTGATGGATTCTTCTCTT GAAAGAATCCATCAGCAGGAATG-3'，PA1537:5'-GATCCGTGACACCGATGTGGTAAACTTCAAGAGAGTTTACCACATCGGTGTCA TTTTTTGGAAA-3'，5'-AGCTTTTCCAAAAAATGACACCGATGTGGTAAACTCTCTTGAAGTTTACCACATCGGTGTCACG-3'，序列合成后参照pSilencerTM5.1 Retro Kit操作说明构建表达质粒pSPA646、pS-PA841、pS-PA1537，之后测序鉴定。

1.2.2 病毒培养及血凝效价测定 病毒经绒毛尿囊腔接种10日龄鸡胚，37℃培养。48 h收获尿囊液，－80℃贮存。在96孔V形板测定病毒血凝价(HA)，病毒经2倍倍比稀释，加入等量1%鸡红细胞悬液(V/V)置微量振荡器上混合均匀，室温静置20 min，以完全凝集的病毒最大稀释度作为病毒效价(HA)。1.2.3 细胞培养及病毒感染 常规方法培养MDCK细胞于细胞瓶中，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃体积分数为5%CO2培养箱中培养，待细胞铺满形成单层后，0.5%胰酶(体积分数)消化，分装于6孔细胞板，1×107细胞/孔，待细胞单层达到80%左右，按照LipofectamineTM2000的说明书分别转染 3μg的 pS-PA646、pS-PA841、pSPA1537，未转染的MDCK细胞孔作为空白对照。转染后18 h，弃去转染混合物，每孔加入103TCID50病毒液150μl于室温吸附1 h，吸附后清洗细胞后，加入2 ml含2μg/ml TPCK-胰酶的病毒生长液于37℃体积分数为5%CO2培养箱中培养。转染后不同时间收获上清液，测定病毒HA。

1.2.4 病毒与 siRNA接种鸡胚 取30μl、10μg siRNA的DMEM，同30 μl Oligofectamine(Invitrogen)混合〔2〕，室温孵育30 min，之后同103TC ID50病毒液100μl一起经绒毛尿囊腔接种10日龄鸡胚，37℃培养，17 h后收获尿囊液测定病毒效价。

1.2.5 反转录与real-time PCR 将MDCK细胞培养于6孔板，1×107细胞/孔，待细胞单层达到80%左右，按照 LipofectamineTM2000的说明书分别转染 3μg的 pS-PA646、pSPA841、pS-PA1537和 Ps-negative，转染后 18 h，弃去转染混合物，每孔加入103TC ID50病毒液150μl，接种病毒后8 h，提取总RNA，用oligo d(T)5'-TTTTTTTTTTTTTTT-3'反转录合成cDNA模板，取2μl进行real-time PCR，用ABI 7300荧光定量PCR仪检测荧光信号，用2△△ct法计算PA基因mRNA相对表达水平，抑制效果以siRNA组与对照组差异的倍数表示。PA的扩增引物序列如下:Pa1:CCTATGTGGATGGATTCGAAC，Pa2:TGGTCGTGGTGTTGTTTTC;β-actin1:CAGAGCAAGAGGGGCATC，β-actin2:AGGTAGTCGGTCAGGTCC。

1.2.6 间接免疫荧光试验 MDCK细胞培养于96孔板，待细胞单层达到80%左右，按照LipofectamineTM2000的说明书分别转染pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537，未转染的 MDCK 细胞孔作为空白对照。转染18 h后攻毒，未攻毒的MDCK细胞孔作为细胞对照。攻毒24 h后去除上清，80%冷丙酮37℃固定2 h，PBS洗3次，鼠源NP单抗作为一抗，37℃孵育1 h，PBS洗3次。FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗(含0.1%伊文思蓝)，37℃孵育1 h，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 表达质粒抑制病毒在MDCK细胞中复制的结果 siRNA转染 MDCK后 24 h、48 h、72 h收获上清液，利用公式〔(HA对照组－HA实验组)/HA对照组×100〕计算抑制效率，结果见表1。转染MDCK后24 h收获的上清液，HA均为0，所以表中未列出。空转染对照组的HA在48～72 h之间达到高峰。而pSPA1537在病毒滴度的高峰时间其HA值仅为32±4，表明它们在一定程度上能够抑制H1N1在MDCK细胞中复制，其病毒抑制率在78%以上。其他siRNA转染组，其血凝效价与空转染对照组相似，其抑制效果不显著。

表1 特异性siRNA对H1N1在MDCK中增殖的影响(x±s)

2.2 表达质粒抑制病毒在鸡胚中的复制结果 表达质粒抑制病毒在鸡胚中复制结果与MDCK细胞实验结果一致。MDCK、pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537 组的 HA 分别为 256 ±37、180±31、220±17、48±9，siRNA 表达质粒(pS-PA1537)可以有效抑制H1N1流感病毒在鸡胚中的复制。因此，siRNAs还可以干扰H1N1亚型流感病毒在鸡胚中的复制。

2.3 各组mRNA表达水平 pS-negative、pS-PA646、pS-PA841、pS-PA1537组的pA mRNA表达量分别为13.5±0.7、7.5±0.4、9.6±0.5、4.3±0.2。PA1537能显著抑制H1N1基因在MDCK中的表达，而pS-PA646、pS-PA841对PA基因的表达干涉作用不显著。感染后8 h，PA1537使PA mRNA的表达水平较对照组降低了3倍。

2.4 间接免疫荧光实验结果 与空白对照组相比，pS-PA1537荧光信号明显减弱。相反，pS-PA646、pS-PA841组与空白对照组相比信号减弱不明显。结果表明，pS-PA1537可以抑制流感病毒蛋白在MDCK中的表达及病毒复制。

3 讨论

本研究应用RNAi技术，选择MDCK细胞及鸡胚作为宿主，以对A型H1N1流感病毒复制起重要作用的PA基因保守序列为作用靶点，成功地构建了哺乳动物细胞pS-PA646、pSPA841、pS-PA1537表达载体，对A型H1N1流感病毒的PA基因从转录后水平进行了抑制，并在核酸水平进行了验证。结果表明，pS-PA1537重组质粒能抑制目的基因PA的RNA转录水平。HA结果表明，在分别转染pS-PA1537的MDCK细胞及鸡胚中，流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制，为进一步体内实验奠定了基础。定量PCR显示pS-PA1537表达的siRNA能够靶向前基因组mRNA，使RNA水平降低。pS-PA1537相比pS-PA646、pS-PA841抑制效果更好，可能的原因是靶位点选择的差异。

应用siRNA进行流感病毒的抗病毒研究已取得进展，Ge等〔3，4〕设计了针对 H1N1 亚型流感病毒基因组(NP、PA、PB1)保守区的siRNA，能够抑制流感病毒在细胞或鸡胚中的增殖。Tompkins等〔5〕将合成的siRNA导入小鼠，明显降低了感染鼠肺中的流感病毒滴度，保护鼠免于致死性流感病毒的攻击，并证明这种保护是特异性的，而不是由抗病毒干扰素应答介导的。本试验较其他研究中的抑制效率略有下降，其原因可能包括以下几方面:(1)与实验操作和技术有一定的关系。(2)病毒的逃逸。H1N1的频繁突变与RNAi的高度序列性之间的矛盾是设计siRNA的难点，虽然选择在病毒高度保守区设计siRNA，但本毒株在保存过程中也可能造成靶基因的突变或碱基的缺失，导致病毒的逃逸。(3)siRNA的设计。目前各种siRNA设计原则不统一，各公司使用不同的规则筛选siRNA，也导致不是所有的siRNA都有抑制效果。(4)合成的siRNA质量不稳定等。siRNA干扰现象是一个很复杂的过程，而且到目前为止仍然有许多机制不清，不同的siRNA抑制效果可能受到目标序列位置、GC含量、二级结构等多种因素的影响。

尽管RNAi技术有许多明显的优点，但也存在一些限制因素，如siRNA并不是对所有的靶向基因都有作用，而是有选择性的，它对某些靶向基因可能表现出较强的干扰作用，但对其他靶向基因却表现出较弱的效应。甚至无效应。对同一靶向基因mRNA来说，可能某些siRNA对其有较强的抑制作用，而另一些siRNA却只有较弱的抑制作用或无作用〔6〕。

在siRNA应用方面也有许多问题需要解决，如靶位的选择、怎样设计出有效地siRNA序列，如何有效的将siRNA分子转运到靶器官并进入靶细胞，给药方式、怎样提高siRNA的稳定性、联合用药、体内实验及作用机制等方面，这些都有待于进一步的研究。

1 Ahlquist P.RNA-dependent RNA polymerases，viruses，and RNA silencing〔J〕.Science，2002;296(5571):1270-3.

2 Elbasir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836):494-8.

3 Ge Q，McManus MT，Nguyen T，et al.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(5):2718-23.

4 Ge Q，Filip L，Bai A，et al.Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(23):8676-81.

5 Tompkins SM，Lo CY，Tumpey TM，et al.Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(23):8682-6.

6 Holen T，Amarzguioui M，Wiiger MT，et al.Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger tissue factor〔J〕.Nucleic Acids Res，2002;30(8):1757-66.