大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区超微结构及Apaf-1表达的变化

刘 瑞 高维娟 钱 涛 王 利

(承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

脑缺血再灌注损伤是指缺血脑组织在一定条件下恢复血液供应后，出现了更加严重的脑功能障碍和结构损伤，常见于休克、DIC微循环再通、脑血管栓塞再通、心肺脑复苏等。缺血性脑血管疾病〔1〕是临床神经科的常见疾病，其致残、致死率高，治疗原则是及时恢复缺血区的血液供应，但同时也造成了再灌注损伤，抑制再灌注损伤已成为治疗缺血性脑血管疾病的重要环节〔2〕。本实验通过建立全脑缺血再灌注大鼠模型，观察大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马超微结构及凋亡蛋白激活因子(Apaf)-1表达的变化，探讨脑缺血再灌注损伤的发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠，SPF级动物，体重260～280 g，鼠龄2～3个月，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号:SCXK(京)2009-0004。SD大鼠适应性饲养1 w后随机分为假手术组和模型组，其中模型组根据再灌注后不同时间点再分为2、24、72 h 3个亚组。

1.2 试剂和仪器 小鼠抗大鼠Apaf-1单克隆抗体，小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;免疫组化试剂盒购自北京中山金桥公司;HRP-DAB底物显色试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂为国产分析纯。WH-A300W型高频电刀:北京市朝阳维思通工程电器厂生产;石蜡包埋机，石蜡切片机:德国LEICA生产;光学显微镜:日本OLYMPUS生产;H-7650透射电子显微镜:日本日立公司生产;TDL-40B离心机:上海安亭科学仪器制造厂;DYY-6B型稳压稳流电泳仪:北京六一仪器厂。

1.3 模型制备 采用改良的Pulsinelli四血管阻断法制作大鼠全脑缺血再灌注模型:大鼠于术前12 h禁食，4 h禁水，4%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉。将大鼠俯卧位固定于固定台上，颈背侧正中纵切口约1.5 cm，逐层钝性分离颈旁肌暴露双侧第一颈椎横突翼状孔，用直径0.5 mm的电凝针烧灼其中的椎动脉，造成永久性闭塞，缝合切口。然后将大鼠仰卧位固定，行腹侧颈正中切口，分离双侧颈总动脉并以“4”号线穿线备用，缝合切口。24 h后将大鼠乙醚麻醉，迅速打开颈部切口暴露双侧颈总动脉，待大鼠清醒后用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成全脑缺血，缺血30 min后松开无创动脉夹恢复脑血液灌流，观察大鼠行为学改变，以双侧颈总动脉夹闭后1 min内大鼠意识丧失、眼球变白、双侧瞳孔散大、对光反射消失、翻正反射消失作为全脑缺血模型成功的标准，且剔除全身强直、抽搐等异常反应或死亡的大鼠。假手术组只做皮肤切口和组织分离。

1.4 电镜样品及标本制备 每组于再灌注后相应时间点从每组大鼠中随机选取6只4%水合氯醛腹腔注射麻醉，先经左心室灌注250 ml生理盐水，再灌注含2.5%戊二醛的4%多聚甲醛300 ml，之后立即断头取脑，在冰上分离出海马，将海马CA1区切成1 mm3的小块，迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h，1%锇酸后固定，常规梯度丙酮脱水，Epon812包埋，半薄切片选区，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，透射电镜下观察。

1.5 免疫组化法检测海马组织Apaf-1的表达 每组于再灌注后的相应时间点从每组大鼠中随机选取6只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经左心室快速灌注250 ml生理盐水，然后灌注4%多聚甲醛500 ml进行固定，取视交叉后4 mm与小脑前之间的部分即海马脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，连续冠状切片，制成5μm厚切片。采用SP法检测Apaf-1的表达，具体操作依据试剂盒说明书进行。小鼠抗大鼠Apaf-1单克隆抗体按1∶75稀释，PBS代替一抗作阴性对照。选用Med6.0软件测定阳性反应物灰度值:在切片的海马CA1区各选取3个测量点，首先测定各点的颗粒细胞层灰度值，再用该值减去相应的背底灰度值后求平均值，即为大鼠海马CA1区Apaf-1表达的免疫反应灰度值。

1.6 Western印迹法检测海马组织Apaf-1蛋白的表达 每组取6只大鼠海马组织(－80℃保存)，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，取80μg蛋白样品，以8%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分离的蛋白用半干电转移法转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，小鼠抗大鼠Apaf-1单克隆抗体(1∶200稀释)4℃孵育过夜，山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀释)室温摇床孵育1 h，洗膜后，采用ECL化学发光法显色，目的条带为130 kD，实验重复5次。用凝胶分析软件Quantity one进行定量分析。

1.7 统计学处理 结果以x±s表示，用SPSS11.5软件采用单因素方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Games-Howell检验。

2 结果

2.1 海马CA1区神经元超微结构变化 透射电镜下观察:假手术组大鼠海马神经元胞核较大，呈圆形或椭圆形，核膜清晰完整，可见核孔，常染色质呈细颗粒状，均匀分布，胞浆内可见丰富的细胞器，细胞器结构形态清晰。模型2 h组可见大鼠海马神经元核膜邹缩、凹陷，核染色质密度增高，线粒体轻微肿胀，可见溶酶体;模型24 h组可见大鼠海马神经元核膜邹缩凹陷严重，核仁物质增多、偏移，线粒体结构松散、空泡状，线粒体嵴断裂或消失，粗面内质网囊性变、脱颗粒，游离核糖体减少，可见溶酶体结构完整;模型72 h组可见大鼠海马神经元核固缩，核染色质成团块状边集于核膜下，线粒体不同程度脱空，可见溶酶体。见图1。

2.2 免疫组化法检测海马组织Apaf-1蛋白表达 免疫组化染色结果:阳性反应为胞浆呈棕黄色。假手术组海马只有少量Apaf-1蛋白表达，与假手术组相比，模型组各时间点 Apaf-1蛋白表达平均灰度值均增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 2，表 1。

2.3 Western印迹法检测海马组织Apaf-1蛋白表达 Apaf-1蛋白表达趋势与免疫组化表达一致，见图3，表1。

表1 脑缺血再灌注后大鼠海马组织Apaf-1蛋白表达(x ± s，n=6)

图1 各组海马CA1区神经元超微结构(×20 000)

图2 各组海马组织Apaf-1蛋白表达(×400)

图3 各组大鼠海马组织Apaf-1蛋白

3 讨论

缺血性脑血管病是以脑循环血量下降为特征的中枢神经系统的常见病及多发病，近年来，细胞凋亡在缺血性脑损伤发生机制中的作用逐渐被认识，1990年Shigeno等〔3〕首先提出全脑缺血的神经元死亡与凋亡有关，此后许多研究表明用不同动物模型和不同检测方法所发现的细胞凋亡情况不同;不完全性短暂性脑缺血时，缺血细胞的早期形态变化与凋亡的形态学特征相一致〔4〕。

细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因主要有Bcl-2家族、caspase家族、癌基因c-Myc、抑癌基因P53等，参与细胞凋亡的信号转导通路很多，而在脑缺血再灌注损伤过程中，主要是JNK信号转导通路，叶冬青等〔5，6〕研究表明，无论是离体培养的大鼠海马神经元缺氧缺糖/复氧复糖后还是在体脑缺血再灌注大鼠海马神经元，都可致JNK3的表达增加进而导致神经元凋亡。在JNK信号通路中，由于一系列的信号转导级联反应均以Apaf-1为靶子而调节凋亡体，因此Apaf-1被认为是凋亡体的核心〔7，8〕。Apaf-1在线粒体介导的细胞凋亡途径中是这样发挥作用的:丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)是一组分布于胞质的进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活的MAPK通过磷酸化多种转录因子、细胞骨架相关蛋白和其他酶类等蛋白底物来调节多种细胞生理过程。JNK是MAPK重要成员之一，目前所知JNK包括JNK1、JNK2和JNK3三种亚型，JNK1和JNK2广泛分布于多种组织，JNK3主要分布于神经组织、睾丸及心肌细胞中。在钙离子超载、氧自由基等应激刺激下，使位于细胞质的JNK3磷酸化而激活JNK信号转导通路，磷酸化的JNK3逐渐转移到细胞核内，促使高电导非选择性通道PTP(PTP)开放和线粒体膜电位崩解，细胞色素C从线粒体内膜间隙释放入胞质，在dATP/ATP存在的条件下，细胞色素C与胞浆中的Apaf-1结合，改变Apaf-1的构象，消除其自身多聚化的作用，使 procaspase-9与Apaf-1结合，并活化为caspase-9，进一步激活下游的效应因子 caspase-3、6、7 等，使细胞走向不可逆凋亡〔9，10〕。本实验结果表明细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中发挥重要的作用，Apaf-1蛋白表达升高促进了神经元的凋亡，是脑缺血再灌注损伤的发生机制之一，这可能成为治疗该类疾病新的分子靶点，为探索防治该类疾病的药物开辟了新的研究方向。

1 崔海月，王庆国.缺血性脑血管病发病机制的新进展〔J〕.长春中医药大学学报，2009;25(2):291-2.

2 陈志强.缺血性脑血管病的研究进展〔J〕.亚太传统医药，2010;6(7):159-62.

3 Shigeno T，Yamasaki Y，Kato G，et al.Reduction of delayed neuronal death by inhibition protein synthesis〔J〕.Neurosci Lett，1990;120:117-23.

4 张 辉，董建峰，呼东坡，等.川穹嗪对大鼠CIR顶叶皮质神经元超微结构及Caspase-9 mRNA表达的影响〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2009;18(4):417-21.

5 叶冬青，高维娟，闫凤霞，等.黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3 mRNA的表达〔J〕.中国病理生理杂志，2009;25(9):1756-61.

6 Liu SS，Gao WJ，Qian T，et al.Effect of different doses of astragalus injection on neuronal apoptosis and expression of caspase-3 in hippocampus of rats after cerebral ischemia reperfusion〔J〕.Chin J Tissue Engineering Res，2012;16(20):3747-50.

7 Pourkarimi E，Greiss S，Gartner A.Evidence that CED-9/Bcl2 and CED-4/Apaf-1 localization is not consistent with the current model for C.elegans apoptosis induction〔J〕.Cell Death Differ，2012;19(3):406-15.

8 Gogada R，Amadori M，Zhang H，et al.Curcumin induces Apaf-1-dependent，p21-mediated caspase activation and apoptosis〔J〕.Cell Cycle，2011;10(23):4128-37.

9 焦俊霞，高维娟.Bcl-2、Bax和Cyt-c在神经系统疾病中作用机制的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(24):4982-5.

10 Kim J，Parrish AB，Kurokawa M，et al.Rsk-mediated phosphorylation and 14-3-3 varepsilon binding of Apaf-1 suppresses cytochrome c-induced apoptosis〔J〕.EMBO J，2012;31(5):1279-92.