骨髓间充质干细胞移植对慢性脑缺血大鼠海马区Cdc42表达及认知功能的影响

于晓云 张博爱 李俊敏 刘 宇 李晓晓 崔 璨 崔红卫

(郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052)

慢性脑缺血是一种能导致神经退行性疾病和严重记忆功能障碍的病理状态，阿尔茨海默病、血管性痴呆、缺血性卒中均与此有关，目前干细胞治疗已成为其一个有吸引力的治疗策略，最常用的干细胞来源于骨髓，研究证明，骨髓间充质干细胞可以通过旁分泌作用分泌脑源性神经营养因子(BDNF)等多种神经营养因子，有效治疗亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化等神经退行性疾病〔1〕。Cdc42是细胞骨架的重要调节因子，其活化后可通过激活Arp2/3介导的肌动蛋白聚合反应，引起细胞骨架重构，调节树突棘的生长，从而改善慢性脑缺血大鼠的认知功能，而骨髓间充质干细胞能否调控Cdc42的表达从而改善认知功能目前尚不明确。大鼠永久性双侧颈总动脉结扎(2VO)是模拟慢性脑缺血的主要方式〔2〕，且术后8～12 w是最接近人类慢性脑缺血后血流改变的阶段〔3〕，故我们通过制作2VO模型产生慢性全脑低灌注，用Morris水迷宫筛选出造模成功的大鼠，分别于术后8、10、12 w检测大鼠行为学改变，通过免疫组化和Western印迹检测海马区Cdc42表达的变化。

1 材料与方法

1.1 骨髓间充质干细胞提取、培养、转染及注射 体重约150 g SD大鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5 min，分离大鼠后肢股骨、胫骨，超净工作台内剪开暴露骨髓腔并用全培养基反复冲洗，冲洗液移至离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀细胞于DMEM-F12(10%FBS)培养基中培养，密度为1×106个细胞，置于5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中，2～3 d更换培养基1次。待贴壁细胞接近90%时，将细胞悬液1∶3传代。大鼠造模1 w时取P5代细胞，从尾静脉注射1 ml骨髓间充质干细胞单细胞悬液入老鼠体内(按细胞密度2×106个/ml)。取部分P5代骨髓间充质干细胞，待细胞长至满瓶底的50%时更换含有携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒培养液，感染复数(MOI)为30，至细胞长满瓶底，按上述浓度从尾静脉移植入体内。

1.2 实验动物及分组 购健康雄性SD大鼠(郑州大学实验动物中心)72只，体重450～550 g，随机分为假手术组、2VO模型组、实验组(2VO模型+干细胞移植组)，各组分8、10、12 w三个时间点，每个时间点8只。

1.3 动物模型的制备 采取2VO制造大鼠慢性脑缺血模型〔4〕，术前禁食12 h，禁水4 h，给予10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)，仰卧位固定，颈部剪毛、消毒，取正中切口，逐步剥离出双侧颈总动脉，先后给予近心端和远心端结扎，于两结扎点之间剪断颈总动脉以确保血流中断，逐层缝合。假手术组除不结扎颈总动脉外其他操作均与模型组相同。

1.4 Morris水迷宫测试 Morris水迷宫可用于测试大鼠的空间学习记忆功能，分为隐蔽站台实验和空间探索实验两部分。每天训练开始时将鼠任意从四个象限之一面向池壁放入水中，每次试验鼠共游90 s寻找站台，若成功找到，给予30 s休息时间，若未找到，引导至站台，同样给予30 s休息时间，共训练4 d，每天上午2次，下午2次。隐蔽站台实验结束24 h后撤除平台，将鼠从一固定象限入水，由图像自动监视和处理系统记录大鼠的逃避潜伏期。训练后即手术取脑。

1.5 脑组织切片的制备及Cdc42的免疫组织化学的检测 各组大鼠达到规定时间点后，10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定备皮，剪开胸部皮肤暴露心脏，在左心耳处刺一小口引流血液，在主动脉弓插一针头灌注4%多聚甲醛，直至大鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线，开颅取脑，将其放入4%多聚甲醛中过夜，石蜡包埋后4 mm连续切片，取海马区观察。采用山羊超敏二步法行免疫组化检测，依次烤片、脱蜡水化、0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液95℃水浴15 min，H2O2室温避光封闭10 min，一抗(sc-6083美国Santa Cruz公司)以1∶75浓度4℃过夜，生物素二抗(PV-9003北京中杉金桥)室温孵育20 min，DAB(北京中杉金桥)显色，镜下控制反应时间，苏木素复染后盐酸酒精分化，脱水透明、中性树胶封片。用PBS液代替一抗设立阴性对照。用倒置显微镜观察Cdc42的阳性细胞数并计数，在400倍视野下计数5个不重复视野中的阳性细胞个数，取平均值。

1.6 Cdc42蛋白样品的制备及Western印迹检测 各组大鼠达到规定的时间点后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧位固定，快速开颅取脑，于冰上解剖取出海马，小组织剪剪碎，以1 ml/100 mg加组织裂解液RIPA(R0010北京索宝莱科技公司)，冰上研磨30 min，12 000 r/min 4℃离心，取上清，加上样缓冲液100℃变性10 min，－20℃保存备用。

Western印迹检测:用聚丙烯酰胺电泳获得Cdc42蛋白，浓缩胶6%，电压80 V，分离胶12%，电压100 V，半干转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗1∶500过夜，二抗(IH-0051北京鼎国昌盛)1∶1 000，ECL(CW-0049北京康为世纪)显色，暗室曝光，定影、显影。以β-actin(CW-0096北京北京康为世纪)作为内参对照，扫描胶片后以目的蛋白的灰度值与内参的灰度值比值进行统计分析。

1.7 统计学分析 用SPSS17.0软件进行统计学分析，检测数据的正态性和方差齐性，用单因素方差分析和两两比较t检验，所有的结果用x±s表示。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞培养、转染及移植结果 见图1。

图1 骨髓间充质干细胞

2.2 水迷宫测试结果 如表1所示，假手术组大鼠潜伏期无统计学差异(P＞0.05)，随时间的延长模型组和实验组大鼠潜伏期均逐渐延长(P＜0.05)，相同时间点，实验组大鼠较模型组大鼠潜伏期缩短(P＜0.05)。

2.3 免疫组织化学测试结果 DAB染色结果如图2所示:假手术组大鼠海马区神经元数量丰富，三个时间点无明显差异(P＞0.05)，模型组大鼠海马区神经元变性坏死、数量缺失明显增多，且随着时间延长程度逐渐加重(P＜0.05)，实验组海马区神经元变性坏死、细胞缺失程度较模型组明显减轻(P＜0.05)，随时间延长细胞缺失程度逐渐加重(P＜0.05)。见表2。

2.4 Western印迹测试结果 如图3所示:假手术组Cdc42蛋白表达无明显差异，模型组蛋白表达明显减少，且随时间延长逐渐降低，实验组蛋白表达较模型组增高，与水迷宫及免疫组化结果一致。见表3。

表1 大鼠在水迷宫试验中的平均逃避潜伏期(x ± s，n=8)

表2 大鼠海马CA1区阳性细胞数(x ± s，n=8)

表3 各组大鼠海马Cdc42蛋白Western印迹相对灰度值(x ±s，%，n=8)

图2 各组大鼠海马CA1区Cdc42的表达(DAB，×400)

图3 海马区蛋白Cdc42的Western印迹检测结果

3 讨论

慢性脑缺血是引起认知功能障碍最常见的原因之一，在2VO慢性脑缺血模型中，脑组织通过一系列损伤级联反应引起神经元及神经突触的进行性减少。神经突触，尤其是兴奋性突触是认知功能的基础，大多数兴奋性突触位于神经元树突棘(树突表面的小突起)的尖端。大脑海马区在维持认知及记忆功能中起着至关重要的作用，2VO模型中，海马区神经元减少尤为严重，从而影响大鼠学习和记忆功能〔5〕。Cdc42是Ras超家族中小分子量G蛋白成员之一，具有GTP酶活性，在大鼠的海马、小脑、丘脑、大脑皮层均有表达〔6，7〕，Cdc42 被激活后可调控神经元的形态和极化活动，包括细胞的分裂、迁移，轴突发芽、生长和伸长率，以及再生和突触可塑性〔8〕，其调控路径是多样的，例如:与GTP结合的Cdc42可通过与WASP及其亚型的相互作用参与调节肌动蛋白的聚合和丝状伪足的形成〔9〕，活化的Cdc42可联合活化的PAKs通过丝氨酸/苏氨酸激酶LIMK1途径改变细胞骨架〔10〕，其通过PAR蛋白家族调节小鼠皮质和海马区结构的形成及细胞分化、星形胶质细胞突触生长方向〔11，12〕。通过以上途径均可调控海马神经元树突棘的生长，进而改善大鼠的记忆及认知功能。

间充质干细胞是中胚层细胞的基质前体细胞，可从几乎所有结缔组织中分离，具有易于获取、来源丰富、没有明显移植排斥反应等优点，在神经系统疾病治疗中具有巨大应用前景。本实验通过观察骨髓间充质干细胞移植后慢性脑缺血大鼠海马区Cdc42的变化，发现随着时间的延长，大鼠海马区Cdc42表达逐渐减少，空间认知功能逐渐下降，而干细胞移植组大鼠Cdc42的表达均比相对应时间点2VO模型组多，且大鼠认知功能均有改善，说明骨髓间充质干细胞移植后可通过某种途径提高Cdc42的表达，调控树突棘的生长，进而改善神经系统的发育、损伤后修复、学习、记忆等多种功能。我们推测，干细胞移植后可通过旁分泌途径分泌BDNF等多种神经营养因子，通过其 TrkB 受体，磷酸化 Ephrin-B，进而活化 EphB2〔13〕，EphB2 活化Cdc42后，通过上述途径调控树突棘的生长，改善慢性脑缺血大鼠的认知功能障碍。

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