分化抑制因子1对结肠癌HT－29细胞增殖的影响

于 游 张才全

(重庆医科大学附属第一医院普外科，重庆 400016)

Id蛋白，又称为分化抑制因子(Id)，从属于 bHLH(helix- loop-helix，HLH)转录因子家族〔1〕。Id1分子是新的准原癌基因，在多种肿瘤中有异常的表达，参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润、迁移以及肿瘤血管生成等多方面相关行为的调控，其参与肿瘤发生和进展的机制尚不完全清楚，但鉴于Id1在肿瘤多个环节中的作用，并且在成体组织中几乎不表达，Id1成为一个很有潜力的新的肿瘤治疗靶点〔2〕。Id1在结肠癌组织中表达明显高于正常组织及结肠癌旁组织〔3〕，故研究Id1与结肠癌的关系，对于进一步阐明结肠癌的生物学行为以及治疗将会有积极意义。本研究在体外过表达及抑表达Id1情况下检测结肠癌HT-29细胞VEGF mRNA和蛋白的表达情况以及肿瘤细胞增殖情况，以探讨Id1在结肠癌细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 HT-29(人结肠癌细胞，中科院上海细胞库提供);Id1一抗购于Miliipore公司;GAPDH一抗购于santa cruz公司;山羊抗兔二抗购于北京中杉生物有限公司;RNA提取试剂盒购于Takara公司;RT-PCR试剂盒购自Tiangen公司;Trisbase购于上海生工生物工程有限公司;EXTaq酶购于Takara公司;dNTP购于Takara公司;VEGF一抗购于Miliipore公司;脂质体Lipofect amine 2000购于Invitrogen公司;Id1基因的特异性小干扰RNA(siRNA)Si-Id-1-001(19 bp)〔4〕由广州锐博生物公司设计与合成，各自的正义和反义序列分别为:正义链5'-UGA GCA AGG UGG AGA UUCU dTdT－3'，反义链 3'-dT-dT ACU CGU UCC ACCU CUA AGA-5'。

1.2 细胞培养与Id1过表达及抑表达质粒构建及转染 人结肠癌细胞株HT-29经复苏后，常规培养于含10%新生小牛血清，青霉素(100 U/ml)，链霉素(100μg/ml)的RPMI1640培养基中。Id1全长基因扩增 Id1:上游引物:5'TAACTGTTCCATTTTCCGTA 3'，下游引物:5'TTACCACCATCTAAATTATTTG 3'扩增长度:975 bp，退火温度:60℃，采用Pfu保真酶扩增。PCR扩增Id1片段，利用限制性内切酶EcoR I和NotI将其连接至载体pGEx-4T-1，将连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定后测序。转染前1 d，将2.5×105个细胞/孔接种于6孔培养板，过表达实验分为以下3组:空白组、对照组(空载体组)、过表达组;抑表达实验分为以下3组:空白组、对照组(空载体组)、抑表达组。各组均在37℃，1%O2，99%N2，5%CO2恒温培养箱培养12 h后进行转染，染实验参照Lipofectamine 2000产品说明书进行操作。待细胞转染48 h后，分别用TRizol和RIPA裂解液提取细胞总 RNA和细胞总蛋白。

1.3 RT-PCR检测Id1、VEGF mRNA 参照Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总的RNA。Id1上游引物:5'CTGAGGCACTGGCGAGGAGA3'，下游引物，5'GAGAAGCACCAAACGTGACCAT 3'，扩增长度:140 bp，退火温度:59℃。GAPDH上游引物:5'ACCCACTCCTCCACCTTTGA 3'，下游引物:5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCC 3'，扩增长度:107 bp，退火温度:58℃。VEGF上游引物:5'GGGCAGAATCATCACGAAGT 3'，下游引物:5'GATGTACTCGATCTCATCAGGGT 3'，扩增长度:117 bp，退火温度:60℃。反应体系:1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA 模板200 ng，引物浓度 0.4 μmol/L，Taq 酶 1.25 U，反应总体积25μl。按照RT-PCR试剂盒进行PCR扩增:1μl DNA样本作为PCR扩增模板，阴性对照扩增模板为去离子水;扩增条件为95℃预变性2 min;随后95℃10 s，退火温度15 s，72℃ 延伸45 s，共40个循环;最后72℃延伸10 min。实验重复3次，取其平均值。

1.4 Western印迹检测Id1、VEGF蛋白 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白后，用Western印迹检测Id1、VEGF蛋白。每106个细胞加入500μl细胞裂解液，冰上放置30 min裂解细胞，12 000 r/min离心20 min，收集上清液，测定提取的总蛋白浓度。取等量蛋白样品50 g进行8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以GAPDH/Lamin蛋白作为等量蛋白质上样对照。然后将蛋白转移至PVDF膜上，经5%脱脂奶粉封闭，分别与Id1、VEGF多克隆抗体(浓度为1∶1 500)4℃反应过夜及相应的羊抗兔二抗(浓度为1∶3 000)反应，加入化学发光剂ECL反应，显色，密度扫描分析。实验重复3次，取其平均值。

1.5 MTT实验 取各组对数生长期的HT-29细胞，以每孔103接种于96孔板内，加入条件培养基。在第1～8天，每天每种条件培养基的细胞各取出3孔加入MTT溶液(5 g/L)20μl，继续37℃孵育4 h后，吸弃培养上清，加入DMSO 150μl，振荡10 min。在ELISA检测仪上测定各孔的A490 nm值。以时间为横坐标，3复孔的平均光吸收值为纵坐标，绘制HT-29细胞生长曲线。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计量资料以x±s表示，采用t检验。

2 结果

2.1 Id1过表达验证 采用Western印迹法检测空白组、对照组(空载体组)、过表达组 Id1/GAPDH蛋白分别为:0.287±0.031 4、0.320±0.047 6、0.845±0.138 0，相对于对照组(空载体组)，Id1过表达组Id1蛋白表达明显增加(P＜0.01)，Western印迹见图1，证实Id1过表达成功。

图1 Id1过表达对Id1蛋白表达的影响

2.2 过表达后各组VEGF mRNA和蛋白表达变化 转染Id1表达质粒后采用RT-PCR法检测空白组、对照组(空载体组)、过表达组VEGF/GAPDH mRNA分别为:0.002 99±0.000 687、0.003 49±0.001 34、0.031 3±0.006 05。采用 Western印迹法检测空白组、对照组(空载体组)、过表达组VEGF/GAPDH蛋白分别为:0.132±0.035 1、0.131±0.053 0、0.245±0.032 6，Western印迹见图2。相对于对照组(空载体组)，Id1过表达组VEGF mRNA、蛋白表达明显增加(P＜0.01)。

2.3 过表达后各组MTT结果 培养第1天，各组间吸光度(OD值)相比无显著性差别(P＞0.05);培养至第2天起，过表达组增殖活性增强(P＜0.05)，从培养第3天这种差别越明显(P＜0.01)，提示转染Id1过表达质粒后对细胞的增殖活有明显影响;转染空白组与对照组的生长曲线非常接近，说明其增殖活性不受影响。见表1，生长曲线见图3。

图2 Id1过表达对VEGF蛋白表达的影响

表1 Id1过表达各组MTT法各组OD值(x±s)

图3 过表达各组生长曲线

2.4 Id1siRNA干扰效率验证 采用Western印迹法检测空白组、对照组(空载体组)、抑表达组 Id1蛋白的表达分别为0.450±0.036 9、0.526±0.146、0.192±0.080 0，相对于对照组，Id1抑表达组Id1蛋白表达明显降低(P＜0.01)，证实Id1抑表达成功。Western印迹结果见图4。

2.5 干扰后各组VEGF mRNA和蛋白表达变化 采用RTPCR法检测空白组、对照组(空载体组)、抑表达组VEGF/GAPDH mRNA分别为:0.006 16±0.000 829、0.006 26±0.000 447、0.002 3±0.000 308。采用Western印迹法检测空白组、对照组(空载体组)、抑表达组 VEGF/GAPDH蛋白分别为:0.450±0.039 3、0.464±0.023 1、0.231±0.027 3。Western 印迹结果见图5所示。Id1抑表达能显著下调VEGF mRNA和蛋白表达(P ＜0.01)。

2.6 干扰后各组MTT结果 培养第1、2天，各组间吸光度(OD值)相比无显著性差别(P＞0.05);培养至第3天起，抑表达组增殖活性减弱(P＞0.05)，随着时间的延长，抑表达组细胞从第4天开始出现较为明显的生长抑制，表现为OD值较对照组明显降低(P＜0.01)。空载体组与对照组的生长曲线非常接近(P＞0.05)，说明其增殖活性不受影响。见表2，生长曲线见图6。

图4 Id1抑表达对Id1蛋白表达的影响

图5 Id1抑表达对VEGF蛋白表达的影响

表2 Id1抑表达各组MTT法各组OD值(x±s)

图6 抑表达各组生长曲线

3 讨论

结肠癌发生不仅是癌细胞不断增殖的过程，也是细胞分化不断抑制的过程，结肠癌细胞的恶性程度与分化程度密切相关。细胞的分化程度提示肿瘤的良恶性，并直接影响其预后。Id1是1990年 Benezra等〔5〕从小鼠红白血病细胞互补 DNA(cDNA)文库中克隆出来的。它与一些转录因子结合成非活性异二聚体后，抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH转录因子结合，负调节转录因子的活性，从而抑制细胞分化，从而促进细胞增殖〔6〕。目前确定在20多种人类肿瘤(包括大肠癌、鳞癌、子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌等)中均有 Id1过表达，提示Id1在肿瘤的发生过程中可能起重要作用，可将其作为这些肿瘤的一个新标志物〔7〕。敲除Id1基因的荷瘤小鼠身上发现肿瘤不能生长和转移，显示出广泛坏死和少血管，血管缺乏分枝出芽。在胰腺肿瘤组织中，Id1的表达水平越高，肿瘤中的血管密度指数也就越高，都提示Idl的表达和肿瘤的血管发生密切相关〔8〕。对前列腺肿瘤进行的研究也发现同类现象〔9〕。在消化系统的肿瘤中，Id1在结肠癌、胰腺癌中的表达也异常增高，Id1蛋白在结肠黏膜的正常组织中没有表达，而在结肠癌组织中的表达明显高于正常组织及癌旁组织。这些均提示Id1蛋白在肿瘤新生血管形成中可能起重要作用。在四个已发现的Id分子中，Id1在肿瘤中的异常表达更为普遍。但Id1蛋白与其他蛋白相互作用机制及调控Id1基因表达上游因子和Id1蛋白的下游效应因子还不清楚。

肿瘤是一种细胞增殖的疾病，其生长方式及转移要依赖于新生血管网的产生。实验证实，当肿瘤体积小于2～3 mm时，肿瘤生长所需营养物质均来源于邻近的血供系统〔10〕。当肿瘤体积大于2～3 mm时，邻近的血供系统就无法满足肿瘤生长所需的营养，肿瘤细胞诱导其特异性血管网的形成机制便开始发挥作用。VEGF是目前发现肿瘤诱导产生血管网的最重要的细胞因子。VEGF广泛的表达于内皮细胞、成纤维细胞及肿瘤细胞等多种细胞。但VEGF的受体则仅存在于血管内皮细胞上，故VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的因子。研究证实VEGF是刺激恶性肿瘤血管形成的重要生长因子〔11〕。也有研究报道〔12〕VEGF与一些恶性肿瘤的血行转移有密切关系 。本实验通过正反两方面检测了Id1上调和下调后VEGF的表达，上调Id1后VEGF mRNA及蛋白均显著提高，这种提高出现在转录水平上，同时肿瘤细胞增殖明显加快;下调Id1后VEGF mRNA及蛋白均显著降低，也出现在转录水平上，而肿瘤细胞增殖明显减慢。以上结果证实了Id1通过下游因子VEGF来产生新生血管网，从而影响肿瘤细胞的增殖。

本研究证实了在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游因子，其在结肠癌细胞增殖中发挥重要作用，Id1有望成为结肠癌治疗的一个新靶点。但Id1通过何种信号途径来调VEGF，以及调控Id1基因表达上游因子有待今后实验中进一步明确。

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