苜蓿多糖提取工艺及其生物活性研究进展

2013-08-15余凡杨恒拓葛亚龙王斌斌田光辉

杭州化工 2013年1期

余凡，杨恒拓，葛亚龙，王斌斌，田光辉

（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中723000）

苜蓿是一年生或多年生的草本、稀灌木，无草本气味，适应性强，可以在各种地形、土壤中生长，是世界上分布最广泛、最古老的豆科栽培牧草，有“牧草之王”、“饲料之王”之称。我国苜蓿的种植面积为 183hm2，居世界第五位［1］。

苜蓿多糖是从苜蓿中提取的一类多糖，被证明具有一定的生物活性［2］。苜蓿多糖和一些其他植物多糖一样，在动物研究中表现了很好的生理作用。苜蓿多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用，对机体的毒性很小。苜蓿多糖是一类很值得利用的绿色保健品和饲料添加剂，在药用方面也表现出了广阔的市场前景［2，3］。本文对苜蓿多糖的提取工艺、化学结构、生理作用和应用前景进行了综述。

1 苜蓿多糖的化学结构

多糖是由单糖聚合而成，是由聚合度超过10的极大分子。由于多糖组分中单糖种类繁多，连接形式千差万别，所以多糖化学结构较为复杂，一般方法提取的多糖通常都是混合物［4，5］。多糖结构的鉴定主要有两种方法：化学分析法和物理分析法。化学分析法又包括酸水解、甲基化、过碘酸及其盐的氧化、Smith降解、碱降解、酶水解免疫化学技术等方法。物理分析方法包括 IR、MS、GC－MS、NMR等方法。根据不同的物质中的多糖可以选择不同的鉴定方法［6］。

苜蓿多糖是一种非淀粉多糖，浅黄色粉末，易溶于水，不溶于80%的乙醇水溶液，性质稳定。用茚三酮法检验苜蓿多糖，其中不含蛋白质、鞣酸和淀粉，为酸性多糖。经三氯醋酸水解，薄层层析检验，其中含葡糖糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和另一种未知的单糖，经超滤波法检验，苜蓿多糖分子量在 2 万～6 万［2］。

2 苜蓿多糖的提取

2.1 碱提取法

对于一些含有糠醛酸的多糖，用碱液提取比起用其他方法有更高的提取率。碱提法的原理是：植物细胞在碱液中会吸水溶胀以至于破裂，使细胞中的多糖释放溶解在稀碱溶液中，使其提取率大大提高。常用的碱液有NaOH、Na2CO3、KOH、Ca（OH）2。但有些多糖在碱性较强时会水解，为了防止多糖的降解，通常要通入N2或者加入硼氢化钠或硼氢化钾来保护多糖。碱提法对多糖提取率的影响主要有：碱的浓度、提取温度、提取时间［7］。碱提法既节约时间，又减少了原材料和试剂的消耗，但碱液会与还原糖发生美拉德反应［8］，将还原糖分解，使溶液的颜色加深，加重了后续的脱色工作。向东等［9］用碱提法提取南瓜中的多糖，实验发现，通过碱提后，南瓜细胞变得疏松，细胞间排列变得松散，有的细胞壁甚至处于溶解状态，这对南瓜多糖的提取有利。但碱提时发生了美拉德反应，且碱液浓度越高颜色越深，还原糖的含量越低。赵晨淏等［10］用几种不同的方法提取龙眼中的多糖并研究了不同方法提取的龙眼多糖的性质，结果表明：碱提法的提取率较低，且碱提法提取的龙眼多糖DDPH·清除能力、氧自由基吸收能力和还原能力都较低，但采用碱提法得到的龙眼多糖粘度较高、半乳糖的含量高达42.15%，比其他方法得到的半乳糖高许多，所以对于含半乳糖较多的多糖，用碱提法可以有较高的提取率，但易降低提取的多糖的生物活性。

2.2 酸提取法

对于一些酸性多糖，更适合用酸提法提取。其原理和碱提法基本类似，方法是：在一定温度下，用酸性介质浸泡样品一定时间后，再将溶液的pH调至中性，再加乙醇沉淀。但酸提法操作时应严格控制其酸度，且在酸性介质存在时，会引起多糖中的糖苷键的断裂，破坏多糖的结构，所以此方法很少用。赵晨淏等［10］用酸提法得到的龙眼多糖，粘度较大、半乳糖醛酸的含量较其他方法提取的含量都要高，但DDPH·清除能力较小。所以对于含有较多半乳糖醛酸的多糖可以考虑用酸提法。

2.3 水提取法

用水提取是一种比较传统的方法，在一些植物多糖的提取中较为实用。具体方法是先将样品用有机溶剂回流脱脂和脱除其中的色素，然后按一定的料液比加入热水浸提一定时间，减压真空抽滤，滤液浓缩，加入一定的乙醇沉淀，离心得到沉淀，用丙酮、乙醚、乙醇洗涤沉淀，低温干燥便可得到多糖。此方法的原理是，植物细胞在热水中软化破裂，溢出多糖。优点是：无需复杂的仪器设备，成本较低，操作简单，基本不破坏多糖的结构，且无污染。缺点是：需多次提取，耗费时间。张东杰等［11］用水提法提取苜蓿中的多糖，以温度、时间、浸提固液比、提取次数为单因素结合正交试验，得出提取的最佳工艺条件：浸提时间为1h，温度为100℃，固液比为1∶40，浸提三次。在此工艺条件下，粗多糖提取率达6.80%，经醇沉、5%的三氯乙酸正丁醇溶液及氯仿正丁醇溶液（5∶1）分离纯化，可以得到脱蛋白多糖。蔡彬新等［12］用水提法提取海带中的多糖，提取率达7.9%。

2.4 超声波提取法

超声波提取是利用超声波高频振荡的空化作用、机械作用和热力学作用。超声波在振荡时的空化作用会产生空化泡，空化泡在振荡中不断运动涨大并破裂，在破裂时吸收声场的能量在极短的时间和极小的空间内释放，产生高温高压的环境，同时产生激波，使细胞壁破裂，释放出内含物，直接进入溶剂中混合。另外超声波在运行过程能对溶剂进行加热，从而促进细胞内有效成分的溶解。超声波提取的具体方法是：将样品加入一定的溶剂后放入超声波中浸提一定时间，然后过滤，浓缩，加入一定的乙醇沉淀。超声波的处理温度低，与传统的水提法比较，时间较短，提取率较高。不足之处是：超时间的振荡可能导致大分子多糖断裂，影响其生物活性。吕明生等［13］用超声波提取雪莲薯中的多糖，结果表明，提取率可高达53.3%。陈红等［14］用超声波提取水溶性大豆中的多糖，提取率达8.82%，经Sevag去蛋白纯化多糖回收率为 60.30%。

2.5 微波提取法

微波是频率介于300MHz到300 GHz之间的高频电磁波，它具有强大的穿透力，能够透过细胞壁到达细胞的内部，使细胞内部产生高温高压，当压力超过细胞所能承受的压力后，细胞就会自动破裂，细胞内的有效成分就会释放出来，进入周围的溶剂中。此法可以明显地缩短反应时间，提取效率高，操作简单，在一些植物多糖的提取中被广为使用。刘小丽等［15］用微波法提取香菇中的多糖，最佳提取时间仅需5 min，提取率可达9.46%，用离子交换树脂去蛋白后纯度可达85%。蒋文明等［16］用微波辅助碱液提取仙草中的多糖，最佳提取时间仅需90 s，提取率能达43.84%。所以微波提取可大大节约提取时间。

2.6 酶解提取法

酶在较温和的条件下可以将植物细胞分解，使细胞内的有效成分释放出来。同时利用酶的高选择性，可以降低细胞壁、蛋白质等对细胞内多糖的阻碍，获得较高的提取率。此外用蛋白酶可以除去细胞内的蛋白质，以便得到较纯的多糖。具体方法是：在温水中加入一定量的生物酶，在合适的pH下，加入一定的样品浸提一定的时间，再过滤，浓缩，最后加入一定量的乙醇沉淀即可得到相对较纯的多糖。石勇等［17］用复合酶法提取红枣中的多糖，提取率达 4.61%，高于水提法的 2.69%，可以看出复合酶法较水提法有很大的优势。

2.7 超滤提取法

超滤提取法是利用超滤膜分离得到植物多糖。由于超滤膜特殊的不对称微孔结构，在一定压力下，可以使水等溶剂通过，而多糖、胶体、蛋白质等大分子不能通过。用超滤膜分离得到的多糖，不会破坏其生物活性，产率高，无污染，耗能低，设备简单。张雪婷［18］用超滤法和醇提法两种方法提取苜蓿中的多糖，结果表明：超滤法的多糖平均得率明显高于醇提法的多糖得率。

2.8 超临界萃取法

超临界萃取是以超临界流体为溶剂，从样品中萃取某种成分的技术。超临界流体既具有气体的高扩散性，又具有液体的高溶解性。目前超临界CO2流体在天然产物的提取分离中已广泛运用。超临界CO2流体具有极好的溶解性、效率高、无污染、安全可靠等优点，在天然产物的提取中有很好的应用前景。张素霞［19］用超临界CO2提取香菇中的多糖，与传统的水提法相比，多糖的提取率高了3.16%，且产品的色泽、风味更加接近标准品。

比较以上几种方法可知：多糖的提取最节省时间且有较高提取率的是微波提取法；对于含半乳糖较多的多糖，用碱提法较好，因为碱提法对半乳糖可以有较高的提取率；对于含有较多半乳糖醛酸的多糖，用酸提法较好；但要对提取的多糖做定性试验时，应尽量避免用碱提法和酸提法，以免较大程度地降低多糖的生物活性，可以考虑用超滤法或超临界萃取法，尽可能多地保持多糖的生物活性。酶解提取法可以得到相对较纯的多糖。

3 苜蓿多糖的生理作用

3.1 免疫调节作用

苜蓿多糖是具有生物活性的植物多糖，能增强动物的免疫功能，具有抗感染、抗肿瘤、降血脂、抗辐射等药理活性。它能促进单核细胞的增殖，激活和增强巨噬细胞的免疫功能，促进多种细胞免疫因子的分泌，增强T淋巴细胞、B淋巴细胞的功能和杀伤细胞的活性［2］。

张军等［20］用苜蓿多糖作为免疫增强剂，进行了苜蓿多糖强化猪瘟兔化弱毒疫苗实验，结果表明：苜蓿多糖作为免疫增强剂，能使猪的外周血液中B淋巴细胞数量明显增多，血清IgG水平提高。江振莹等［21］报道，在肉仔鸡早期生长阶段添加水溶性多糖能促进巨嗜细胞吞噬能力和T细胞转化能力，对体液免疫应答能力和生产性能无显著的影响。

3.2 抗肿瘤作用

多糖具有抗肿瘤作用，可被用作抗肿瘤及辅助药物开发。研究表明，香菇多糖具有很好的抗肿瘤作用。苜蓿多糖本身尤其是经异构化或修饰后，具有很好的抗肿瘤作用［2］。张东杰等［22］用水提—醇沉法得到苜蓿粗多糖，经DEAE－Cellulose离子交换层析，用NH4HCO3溶液分段洗脱后得S1、S2、S3和S4四种组分，将这四种组分和粗多糖S0分别通过腹腔注射于移植S－180腹水瘤和H－22腹水瘤的小鼠，结果表明，S1、S2能明显抑制S－180腹水瘤和H－22腹水瘤小鼠体重的增加，不同组分的多糖与对照组相比均能延长荷瘤小鼠的生存期，且S1、S2表现得极明显，说明苜蓿多糖能辅助治疗肿瘤。

3.3 抗病毒作用

多糖作为生物免疫活性调节物质，还具有抗病毒作用，被用作抗病毒药物开发。含磺酸基的海藻类多糖和硫酸酯化匀多糖如卡拉胶、右旋糖等抗病毒效果良好［23］。它的抗病毒的作用机制可能是增强机体免疫功能，抑制感染细胞的复制，竞争性地结合病毒与细胞的结合位点。张丽萍等［24］使用水提—醇沉法从苜蓿中提取粗多糖，经DEAECellulose离子交换层析，用NH4HCO3溶液分段洗脱后得 S1、S2、S3和 S4四种组分，将其配置成一定浓度的多糖溶液，采用试剂盒对体外HIV逆转录酶和蛋白酶活性的抑制作用进行检测比较，结果表明：S3、S4对HIV逆转录酶活性抑制率很明显，分别为 99.6%、76.7%，S1、S2 相比而言较弱；但S1、S2对蛋白酶活性抑制率较明显，分别为58.6%、55.9%，S3、S4则较弱。实验表明，苜蓿多糖抗 HIV的作用机制可能是抑制逆转录酶及蛋白酶活性，且具有实际应用价值。

3.4 其他作用

植物多糖作为生物免疫活性物质，还有许多作用，如降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等作用。如茶多糖具有降血糖、降血脂的作用［25］，魔芋多糖具有降血糖、降血脂的作用，灵芝多糖具有降血脂的作用［26］，地黄多糖具有抗衰老的作用［27］，大豆多糖具有抗氧化性［25］。国内外对苜蓿多糖在这方面的作用的报道还很少，有待学者进一步探究。

4 展望

目前我国对苜蓿多糖的利用仅是粗产品，对其研究仅限于实验室，还没达到商业化。国内外对苜蓿多糖结构的研究报道还很少。苜蓿多糖对人和动物的影响和作用机理还有待进一步探究。

虽然苜蓿多糖的研究还存在一些技术不成熟的问题，但其应用前景很广阔。首先对苜蓿多糖的生理作用的研究还不是很深入，许多未发现的药用价值都还需进一步研究。其次，苜蓿多糖的免疫增强效益和抑制HIV逆转录酶和蛋白酶活性的作用，展现了其独特的功效，可以从单纯的动物试验向开发人的营养保健品、医疗用品方向发展，这些都指明了其广阔的应用前景。再者，国际上对糖类的研究日新月异，内容包括糖生物学、糖工程学等，目前日本，美国，欧盟十分重视糖类的研究，都相继启动了研究平台。总之，苜蓿多糖作为一种天然植物多糖，其研究会有很大的价值，加之苜蓿的廉价、资源充足，苜蓿多糖的开发利用具有很广阔的前景。

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