高效液相色谱法检测速溶咖啡中的丙烯酰胺

吕昱 严敏 刘礼祥 （贵州民族大学）

一、引言

随着国家不断的发展，人民生活水平不断的提高，咖啡这种“洋货”早已渗入了普通百姓的日常生活，他口味与真实咖啡味接近且冲泡方法简单，因此速溶咖啡销售量远比传统咖啡大，但多数人并不知道的是，速溶咖啡中有一种潜在杀手“丙烯酰胺”。2005年，中华人民共和国卫生部发布公告：丙烯酰胺是致癌物质，由中国疾病预防控制中心营养与食品安全研究所提供的资料显示，速溶咖啡含丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种用途广泛的重要有机化工原料，是一种中等毒性的亲神经毒物，可通过未破损的皮肤、粘膜、肺和消化道进入人体，分布于人体液中，丙烯酰胺的神经毒性已经为许多学者所公认，孙凤祥等人[8]的研究表明，丙烯酰胺急性中毒后，可使神经细胞产生炎性水肿，最终导致细胞死亡。因此尝试建立高效液相色谱法检测速溶咖啡中的丙烯酰胺，为将来检测速溶咖啡中丙烯酰胺的含量提供重要的参数，对人类健康具有重要的意义。目前食品中丙烯酰胺的测定方法主要以仪器分析为主，一般的化学分析不能达到食品分析的要求。经过一定的萃取、净化处理后，采用气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC)、质谱（MS）及三者联用进行定性定量检测是当前通用的检测手段，GC-MS联用和HPLC-MS联用技术大大提高了测定的灵敏度和准确度，但对仪器设备的要求较高[9]，且GC-MS法需要进行衍生化，实验步骤繁琐且可能因不定因素导致衍生化失败。LC/MS/MS虽然具有较高的灵敏度和准确性，但仪器价格和维护成本过高，不利于推广运用，HPLC法具有相对成本低，样品前处理过程比较简单，分析比较快速、灵敏，准确度比较高等特点。因此本次研究采用了高效液相色谱(HPLC)法测定结果，配合新型小颗粒ZORBAX Eclipse Plus-C18液相柱，分离效果、速度、灵敏度，准确度等比较高，基本上满足了我国“十一五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题有关建立食品中丙烯酰胺测定方法的要求，适用于日常检测，可以进一步推广[12]。

二、实验部分

1、材料与方法

1.1 仪器和设备

美国安捷伦公司1260高效液相色谱仪配紫外检测器，离心沉淀器，涡旋振荡器，长沙湘仪离心机有限公司离心机，GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱，超纯水制备仪，电子天平，Thermo移液枪。

1.2 材料与试剂

美国安捷伦公司 ZORBAX Eclipse Plus-C18(4.6×100mm,3.5μm)色谱柱；美国安捷伦公司AccuBond SPE小柱；纯度≥98%丙烯酰胺标准品购自贵州迪大生物有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯；实验用水均为18.25MΩ.cm超纯水。

1.3 样品来源

速溶咖啡为市场上所购多个品牌样品，所有样品均存放于3℃冰箱内。

1.4 色谱条件

流动相为乙腈：水(v：v,4：96)；流速为 1mL/min；保留时间为1.50min；测定波长为 200nm；柱温：28℃；进样体积为 20μL。

1.5 样品前处理

准确称取1g均质化样品，精确到0.01g，置于10mL具塞玻璃离心管中，用纯水定容至刻度，加少量正己烷进行去脂处理，于漩涡振荡器上振荡10min，然后4000r/min离心10min，吸取下层水相3.0mL到离心管中，在0℃15000r/min高速离心15min，吸取2.0mL下层水相过柱净化。SPE净化：AccuBond SPE(1000mg,6mL)柱用3.5mL甲醇、3.5mL水活化，取2.0mL提取液到SPE柱，用0.5mL水冲洗，用2.0mL水洗脱，收集全部流出液，过0.45μm滤膜后储存于3℃冰箱备用。

2、实验结果

1.标准曲线线性

将丙烯酰胺标准品用纯水配制成 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40μg/mL的标准溶液系列，按其定好的高效液相色谱条件测定，在 0.05～0.40μg/mL 浓度范围内呈线性关系，以浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线的线性方程为Y=423.07X+1.0342，相关系数r=0.99959。

2.样品测定

测定了5份不同的市售速溶咖啡和咖啡豆研磨成的咖啡粉，其中2号为海南春光速溶咖啡，5号为雀巢速溶咖啡，6号为咖啡豆研磨成的咖啡粉，其余为不知名品牌咖啡，每个样品平行测定3次，有的咖啡样品不含丙烯酰胺，有的咖啡样品含少量丙烯酰胺，从检验结果来看首先咖啡豆所研磨的咖啡粉并不含丙烯酰胺，而海南春光速溶咖啡和雀巢速溶咖啡也未检出丙烯酰胺，可见这两种品牌速溶咖啡在加工工艺上处理到位，而其他不知名品牌咖啡则含少量丙烯酰胺。

三、讨论

丙烯酰胺在水中的溶解度较大(2155g/L)，水是丙烯酰胺的理想的提取溶剂，用水提取还可以去除速溶咖啡中的大量有机物。在提取过程中为避免丙烯酰胺变性，不宜加热 （温度不超过40℃）和超声提取[11]，而且加热和超声波震荡可产生微小颗粒堵塞固相萃取柱(SPE)，降低净化效率。对于富含脂肪的样品，需要先用正己烷除去脂肪。本次研究发现，除去脂肪后的样品或脂肪含量较少的样品在0℃15000r/min高速离心后，少量脂肪层被固化，可以轻易被去除，简化了提取步骤，大大提高了提取效率和消除了干扰。