转基因动物的相关研究进展

周 扬，张钦恺，潘庆杰

(青岛农业大学 动物生殖发育与基因工程研究所，山东 青岛 266109)

转基因动物(transgenic animal)是在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA重组技术的基础上，通过实验方法人为地将人们所需要的目的外源基因导入某种动物的受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，随细胞的分裂而增殖，且能稳定地遗传给后代的一类动物[1]。其实质就是按人们的需要有计划、有目的地定向改造动物的遗传组成，赋予转基因动物新的特征，使之更好地为人类服务。

动物转基因技术是21世纪发展最为迅速的生物高新技术之一，它是指通过基因工程技术将外源基因整合到受体动物基因组中，从而使其得以表达和遗传的生物技术。动物转基因的关键限制因素是转基因效率和基因表达的精确调控。

1 动物转基因技术

目前产生转基因动物的基因转移技术有多种，主要有显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体感染法以及其他一些新方法等，每一种方法各有其优缺点，仍然需要进一步研究。

1.1 显微注射法

显微注射法(micro injection)是最先采用的转基因方法，被广泛应用并取得了较好的结果。1980年，Gordon首次利用原核注射的方法开展动物转基因研究[2]。其基本原理是通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，利用受精卵繁殖中DNA的复制过程，将外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。

这种方法的优点是:外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段。外源基因的长度可达100 kb，实验周期相对比较短。但其不足之处是:由于基因整体进入染色体的随机性，使外源基因整合位点和拷贝数无法控制。而且设备昂贵、操作复杂。该方法的外源基因转移整合率小鼠为6%～10%，猪和羊分别为0.98%和1%，鱼类通常可达10% ～15%[3]。

1.2 精子载体法

精子载体法(sperm mediated gene transfer)，即把精子与外源基因的混合溶液，在一定的温度条件下，保留一定的时间，使精子携带有外源基因，当精子与卵子结合时，外源基因便会进入受精卵[4]。

以精子作载体的最大优点是:该方法在转基因家畜生产中具有技术和效率上的优势，克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤，且简单、易行，不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧。主要缺点是:实验结果不稳定，可重复性差。其中进入精子核内的DNA结构是否完整、DNA进入精子核内的比例有多少、DNA进入核内的精子受精能力怎样，以及其受精后能否成功嵌入胚胎染色体中等，是该技术能否取得长足发展的最为敏感而又必须解答的问题。

1.3 逆转录病毒载体感染法

逆转录病毒载体转染法(retrovirusmediated gene transfer):利用逆转录病毒在转染寄主时可以将病毒的一部分DNA整合到宿主细胞的特点，将体外构建的基因重组到病毒载体上，再用带有目的基因的病毒转染动物细胞，以达到将病毒携带的目的基因转入动物细胞的目的[5]。

慢病毒载体法用于制作转基因动物的优点是:方法简单，不受胚胎发育阶段的影响，而且外源基因多位点、单拷贝整合效率高，特别适用于转基因家禽的生产。但其也有缺点:存在病毒载体构建复杂，转入的外源基因的大小受到限制，安全性需提高，可能会造成基因沉默等问题。

1.4 其他新方法

定位整合技术:利用DNA体内同源重组的原理，将外源基因稳定地插入特定的位点，再经适当筛选，从而得到既定的转化细胞[5]。这一技术不仅为基因定位整合进而为哺乳动物种系改造开拓了道路，而且在缺陷基因的修复以及生命科学的理论研究上，都将有很大的应用价值。

转座子介导法:转座子是一类可以进入生物基因组内不同位置的基因载体，它可以自主复制并移动，在经过切割、重组等过程后，转座子中可以插入其他位点，且对插入位点之后的基因产生一定的影响。在转基因研究的应用中，科学家利用它们插入基因导致突变以了解基因功能，也利用它们培育转基因生物。转座子是在很多后生动物中发现的。现主要有两种代表性的转座子:Sleepingbeauty(SB)和 PiggyBac(PB)。SB来源于不同的鱼类基因组中的有缺陷的拷贝序列进行比对，获得最原始的转座子序列，通过点突变获得有活性转座子元件。PB则来源于鳞翅目昆虫。果蝇转座子作为基因载体是很有希望的真核生物基因工程的载体，可用于确认基因、克隆基因、安置基因回到基因组。复旦大学的丁升、李刚等人[6]在《细胞》杂志上报道了在世界上首次创立了一个高效实用的哺乳动物转座因子系统，为大规模研究哺乳动物基因功能提供了新方法。转座子介导法具有整合率高、承载量大以及更容易找到整合位点等优势。

锌指核酸酶技术:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)可以特异地识别并剪切DNA片段中特定基因，通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞。该技术是能够应用于动物转基因上的一种新技术，且已经被成功用于动植物的基因改造实验中，具有非常高的基因整合效率。2003年Poneus等人[7]在美国 《科学》杂志报道了ZFN可以在哺乳动物体细胞上实现基因打靶。2007年 Moehl等人[8]证明了 ZFN技术可显著提高基因的靶向敲除效率。最近研究发现，ZFN技术也可以提高同源重组的效率。

2 转基因动物的研究现状

2.1 提高动物生长率

生长激素(growth hormone，GH)基因是转基因研究中应用最早的基因，1982年Palmiter等[9]用显微注射法首次将大鼠的生长激素基因(rGH)导入到小鼠基因组中并成功表达，获得了体重为正常小鼠两倍以上的“硕鼠”。此后，许多科学工作者都希望通过转移生长激素基因，大幅度提高动物的生长速度，并陆续培育出转基因家禽、啮齿类、鱼类、昆虫等。

最常用的技术是将人的生长激素基因导入鱼和其他动物，如Maclean等把人生长激素基因注入虹鳟的受精卵，Dunham等把人生长激素基因注入到斑点叉尾鱼，Rokkones等将人生长激素基因注入到大西洋鲑鱼和虹鳟。加拿大科学家将一种非常活跃的生长激素基因注入到太平洋鱿鱼的鱼卵中，经过基因重组的鱿鱼平均重量是普通鱿鱼的11倍[10]。1985年，朱作言等也将人生长激素基因(hGH)转入金鱼体内，获得的转基因鱼，其生长速度比非转基因金鱼快2倍。

Hammer R E等[11]将生长激素基因导入猪受精卵中，获得的一头转基因猪生长速度明显较同窝其他猪快，饲料利用率提高了17%，胴体脂肪率明显降低。Pursel V G等[12]把牛的生长激素基因转入猪体内，所获得转基因猪生长速度提高了11%～14%，饲料转化率提高16%～18%。中国农业大学培育的转基因猪，生长速度比对照组高40%。但有些转基因动物却表现出畸形、患病率和死亡高等现象。因此，20世纪90年代以后，动物转基因技术的研究主要转向培育肉质更好的家畜家禽、利用乳腺生物反应器生产药用蛋白、培育抗病家畜家禽、异种培养人体器官等。

2.2 改良动物经济性状

改良动物经济性状有以下几个方面:提高动物体脂肪质量，提高动物乳品质量和提高羊毛产量和品质等。

有关改进动物脂肪质量方面的研究主要见于猪。Pursel V G等培育的IGF1转基因猪，脂肪比对照组减少了10%，瘦肉率增加了6% ～8%[12]。美国科学家培育的19头转基因猪，将背膘厚度从18.5 mm下降到7.0 mm。日本科学家Saeki将菠菜去饱和酶(fad2)基因转入猪体内，培育出来的6头转基因猪体内6型不饱和脂肪酸的含量比普通猪高20%[13]。美国密苏里哥伦比亚大学获得了10头转有线虫去饱和酶(fat1)基因的体细胞克隆猪，转基因克隆猪体内ω6/ω3的比值达到1～2[14]，远远低于正常猪，使猪肉的营养价值得到明显提高。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和军事医学科学院生物工程研究所合作获得了转有脂肪酸去饱和酶基因的转基因克隆猪[15]。这一领域的研究一直受到人们的高度重视。

利用转基因的方法可使牛、羊产出具有不同特性的可以满足人类不同需求的转基因奶。牛奶中的乳糖可引起部分人腹部不适，科学家希望通过敲除合成乳糖的乳白蛋白位点或在乳腺中表达乳糖酶来降低牛奶中的乳糖含量，从而生产出受糖尿病人欢迎的低乳糖奶。黄淑帧等成功培育出了转有人血清白蛋白(hALB)基因的转基因牛。Berkel等培育的转基因牛奶中人乳铁蛋白的含量为300 μg/mL ～ 2 800 μg/mL， 荷 兰 的 Gen Pharm公司培育出的转基因牛，乳中人乳铁蛋白含量达到1 000 μg/mL[16]。Brophy B 等培育的转基因牛，奶中酪蛋白和酪蛋白的含量分别比对照组高20%和100%[17]。敲除奶乳球蛋白基因就可以消除过敏原，使其所产的牛奶不会引起人体过敏反应;转入人乳铁蛋白基因的牛就可以产出含有大量人乳铁蛋白的人源化牛奶。李宁等先后成功获得了转有人乳清白蛋白、人乳铁蛋白、人岩藻糖转移酶、人溶菌酶的转基因奶牛。RehW A等[18]将大鼠硬脂酰辅酶A的基因转入羊体内，获得的转基因羊奶中单不饱和脂肪酸和共轭亚油酸含量明显提高，这种羊奶对心血管病人的健康非常有益。MagaE A等[19]将人溶菌酶基因转入奶山羊，使羊奶中含有人溶菌酶。用这种羊奶饲喂仔猪，可显著降低仔猪胃肠道的大肠埃希菌等数量，从而证明该转有人溶菌酶基因的山羊奶可以预防婴幼儿腹泻等疾病。目前，全世界从事乳腺生物反应器的商业化开发的公司已有十几家，可以进行商业生产的药物有近40种，许多重组蛋白，如抗胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活物(tPA)等已进入临床试验阶段。

利用转基因技术可以提高绵羊的产毛量和羊毛品质。Nancarrow等曾把来自于优质羊毛的一种A2蛋白的主要成分(半胱氨酸)基因导入绵羊原核期胚胎，使转基因羊的产毛量得到明显提高。Bulcock等把人类胰岛素生长因子21(IGF21)基因转入羊的原核胚，使转基因羊的产毛率得到很大提高。Damak等培育出的转有IGF1基因的转基因绵羊平均净毛量比其非转基因羊高6.2%[20]。Powell等将毛角蛋白型中间细丝基因导入绵羊基因组并使其在皮质中得到特异表达，结果转基因羊的羊毛含脂率得到明显提高，光泽十分亮丽。Lazaris等培育的转基因山羊，奶中的重组蛛丝蛋白可以纺成高强度丝线，这种丝线可用于军工和医疗等，被称为生物钢。目前，新西兰、澳大利亚、英国等国家都在努力开发一种可以生产彩色羊毛的高产转基因羊。还有人将貂的长皮毛基因导入羊细胞中，培育出长出类似貂毛皮毛的羊。这类羊容易饲养，繁殖快，所生产的羊貂皮面积比貂皮大几倍[21]。

2.3 提供生物药品

利用转基因技术，可将人们所需要的目的基因直接导入鼠、兔、羊、猪等动物体内，使目的基因在其体内表达，获得可用于治疗或预防人类疾病的转基因生物药品。英国罗斯林研究所不仅培育出世界上第一只克隆羊多利(Dolly)，还培育出能下神奇鸡蛋的小鸡。这种经过基因改造的母鸡所下的蛋DNA中含有一种人体干扰素，可用于治疗癌症和其他疾病。上海医学遗传研究所与复旦大学遗传所合作，于1996年10月成功研制出5头含有人凝血因子的转基因羊，经检测，这些转基因母羊的乳汁中，含有人凝血因子蛋白，这种活性凝血因子是治疗血友病的珍贵药物[22]。

目前很多转基因动物公司都可以生产抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血白蛋白、人血红蛋白及人凝血因子、抗凝血酶、血纤维蛋白原、蛋白质C等。我国江苏省转基因动物制药工程研究中心已经获得了乳腺特异表达人生长激素、乙型肝炎病毒表面抗原、促红细胞生成素、人乳铁蛋白、人溶菌酶等转基因山羊、兔、小鼠和鸡。

2.4 提供动物模型和器官

中国科学院昆明动物研究所成功地培育出转基因猕猴。此成果为人类重大疾病的非人灵长类动物模型的深入研究奠定了坚实的基础。由于非人灵长类在生物学、遗传学和行为学等方面与人类的高度相似性，使之成为人类疾病理想的、甚至是不可替代的动物模型，在治疗、药理药效的临床前安全评价至关重要。转基因动物模型非常适合人类疾病的研究，特别是那些因遗传缺陷引起的疾病，转基因灵长类动物模型能很好表达人类疾病的变异基因。伊斯梅尔教授及其团队用了7年时间培育出含有15%人类细胞的绵羊[22]。他们认为，这项研究的最终目标是在绵羊体内“种”出病人需要的各种可移植器官。假如第一个器官移植失败，还有很多羊可以提供备用器官。这样，这种混血绵羊就成为可给人类提供组织器官的“活体工厂”，也可用于药物试验。

2.5 提高动物的观赏价值

利用转基因动物技术可以生产各种毛色和花纹的观赏动物。美国和日本在转基因观赏动物的研究方面取得了令人瞩目的成果。采用显微注射法将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组表达质粒导入金鱼受精卵中，得到了发绿色荧光的金鱼。美国得克萨斯的一家公司宣布，经过转基因技术已经研制出能发荧光的小型热带荧光鱼。这种荧光斑马鱼被分别转入了水母绿色荧光蛋白或者珊瑚虫红色荧光蛋白的基因，在紫外线的照射下，能够发出绿光或红光，而且光芒四射。日本研究人员利用病毒载体将绿色荧光蛋白基因转入普通狨猴胚胎。结果表明，4只体内胚胎被转入新基因的普通狨猴共生育了5只小普通狨猴，其体内也均有转入的基因，在紫外线照射下，它们脚底等处的皮肤都发出绿色的荧光。其中2只普通狨猴的生殖细胞中也有转入绿色荧光蛋白基因，并用其中的1只培育出了第2代体内含有绿色荧光蛋白基因的普通狨猴。继美国和日本之后，我国东北农业大学也培育出来的绿色荧光蛋白的转基因克隆猪。在紫外线的照射下，这些猪的蹄子、鼻尖、舌头等无毛部位会发出荧光。中科院昆明动物研究所给猴子体内引入了绿色荧光蛋白，所培育的转基因猴子受到蓝光照射时，就会发出绿色荧光。当然，培育这些动物的目的并不仅仅在于观赏，科研工作者希望利用这项技术寻找到治疗诸如阿尔茨海默症和帕金森症等疾病的方法。

3 转基因动物的食品安全性

转基因食品不同于相同生物来源的传统食品，科学家们还无法预见其基因转化后产生新的、未知的蛋白质，也不能完全准确的预见对受体的影响。由于转基因技术本身的不足，转基因食品的开发利用还有很大的争议。虽然中国、美国和加拿大等国家在快速生长的转基因鱼研究方面已经取得了突破性进展，但是迄今为止，全世界还没有转基因动物食品获准上市。

3.1 转基因动物食品的概念

转基因动物食品到目前还没有明确的定义。通常把携带了外源基因并能将其表达和遗传的动物称为转基因动物[23]。人们可以通过基因工程的方法，使转基因动物在性状、营养成分、消费品质等方面向人们需要的目标转化。因此，可以把这种以转基因动物为食物或加工原料而生产的食品称为转基因动物食品。

3.2 转基因动物的安全问题

转基因动物产品的安全问题是其进入产业化阶段的最大障碍之一。转基因动物本身是否会存在健康和福利问题;转基因产品是否会对人体健康产生危害;转基因生物是否会对自然界产生基因污染，破坏生态平衡，这一系列的问题都还需要充分的证据来解答。

3.2.1 转基因动物与其健康

由于外源基因的插入，转基因动物的某些内源基因可能会被破坏或正常表达受到影响，引起转基因动物非目标性状的改变，轻则影响其生产性能，重则影响正常生长发育。Rejduch等[24]对携带牛生长激素的转基因猪的配子发育和繁殖性能研究，结果发现转基因猪交配欲望弱、成功率低、窝产活仔数平均少3头。另外，目的基因在转基因动物体内的过度表达也会破坏正常的内稳态，从而引起其他生理状态的改变。牛奶中重组人血清白蛋白表达水平在40 g/L以上的转基因牛，其产奶期缩短了，而表达水平在1～2 g/L的转基因牛则产奶期相对正常。

3.2.2 转基因动物与食品安全

目前还没有研究报告显示转基因食品确切的危害性。Appel等[25]将转基因牛生产的人重组乳铁蛋白饲喂小鼠，连续饲喂13周后对小鼠进行临床及行为学观察、生理生化指标检测、全身和不同组织器官的显微检测，结果显示，实验组小鼠没有出现明显的不良临床反应。

3.2.3 转基因动物与环境

转基因动物可能会和野生型或其他物种杂交发生基因漂移，危及生态。转基因动物的饲养管理方式，其对环境产生的威胁远低于转基因植物、微生物和鱼等生物。但转基因动物可以通过与野生型动物发生遗传交流来扩散外源基因;另一方面，转基因动物的排泄物可能含有转基因产物，对环境以及人产生潜在的威胁。Wheeler等[26]对携带牛α-乳清蛋白的转基因猪进行环境风险评估，对与转基因猪同圈饲养的非转基因猪、与转基因雄性猪交配2天或7天的雌性非转基因猪的多种器官和组织进行PCR检测，没有发现外源基因的存在。

3.3 转基因动物食品的安全性评价

转基因食品食用安全性评价的基本原则有科学原则、实质等同性原则、个案原则和逐步原则等。其中实质等同性原则是安全性评价的起点，它是指以有安全食用历史的传统食品为基础，要求转基因食品和它所替代的传统食品至少要同样安全[27]。

安全性评价的内容包括外源基因的安全性、基因载体的安全性、转基因过程(插入序列、插入位点、插入序列拷贝数等)、基因插入引起的副作用、基因重组的非预期效应、新表达物质的毒性和致敏性、转基因动物的健康状况、转基因动物及其产品营养成分分析、转基因动物食品在膳食中的作用和暴露水平、食品加工过程对食物的影响、对人体抗病能力的影响以及售后去向和消费人群的流行病学调查[28]。另外，根据所使用的基因重组的方法，还要评价基因载体的感染性，载体上调控元件对宿主细胞的潜在效应，以及调控元件与内源性致病序列发生整合的可能性，但目前还没有合适的方法进行这方面的安全性评价。

但是实验动物的食品安全性实验与以人类健康影响为目的的食用安全性评价有一定差距。因此，要真正对转基因动物进行食品安全性的评价，还需要逐渐建立一套科学健全的评价标准和实验方法。

4 前景

21世纪是生物技术蓬勃发展的时代，要促进我国转基因技术和转基因食品产业的健康快速发展，应该制定适合我国国情的转基因产业发展和生物安全管理政策，正确评估转基因食品的安全性，对转基因技术和食品进行有效评估和监控。转基因动物的成功研制为动物类研究和开发提供了一个广阔前景。在各项条件成熟与完备之后，转基因动物必将大量研制出来并投入大规模商业化生产，它将丰富人们的食品市场，并产生巨大的经济价值和社会价值。

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