中药提取工艺的实验设计方案及数据处理方法

2013-08-15程艳芹,李明春

实用医药杂志 2013年11期

中药及其复方的提取精制是中药研究的关键技术之一，也是决定其药效的最根本步骤。该项研究往往要通过实验设计方案和数据处理来完成。实验设计方案和数据处理方法的选择直接关系到工艺优选结果的可行性及可靠性。本文就中药提取分离工艺优选中常用的统计学方法作一概述，并举例说明它们在中药提取工艺中的应用。

1 实验设计方案

1．1 单因素实验设计(One－factor experimental design) 单因素实验设计又称控制变量法［1］，每次实验只控制单一变量，而其他因素相对固定。在提取工艺优化过程中，常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化。采用固定其他因素改变某一因素的单因素考察法能收到一定效果，但条件优选凭经验，且无法考察各因素间的相互作用。因此，该方法现一般用于预实验，少有单独用于提取工艺优选的。杨万政等［2］用单因素实验法，以绿原酸、牛蒡子苷及总黄酮得率为指标，对溶媒、醇浓度、料液比、提取时间、提取次数和浸泡时间等6因素进行考察，优选了清喉颗粒的提取工艺。

1．2 正交设计(orthogonal design) 当因素水平数较多时，需采用实验次数较少的实验设计优化法。正交设计是按照正交表和相应的交互表进行的实验设计，是多因素多水平实验的效率很高的设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面实验的情况，找出最优的水平组合。正交设计保留了析因设计整体考虑、综合比较的优点，避免了析因设计的全面实验、工作量大的弊病［3］。但必须强调的是，均匀分散和整齐可比是正交设计的本质特征。因此，在应用该方法时，首先应注意所设的因素水平是否均匀分散和整齐可比，否则其后的数据分析几乎没有任何意义。基于这点，沈群［4］指出“提取次数”不能作为正交设计的考察因素。

正交设计目前在我国中药提取工艺研究过程中最为常用。何迅等［5］采用L9(34)正交设计实验，以大黄素、多糖类、咖啡酸等指标成分的动态变化为评价指标，对各工艺参数进行优化，筛选了蒲薏颗粒的最佳醇水双提工艺。傅亮等［6］采用正交设计法研究了四逆泡腾片中干姜油的提取及其β－环糊精包合的最佳工艺。挥发油提取工艺考察因素为加水倍量、浸泡时间、蒸馏时间，考察指标为挥发油提取量。童荣生等［7］通过正交实验，以小檗碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素的含量为评价指标，考察了加水量、浸泡时间、煎煮时间对半夏泻心汤水提醇沉工艺的影响。郝伟伟等［8］采用单因素结合正交设计法，优选出65%乙醇溶液为提取溶媒，进一步考察了微波功率、微波辐射时间、乙醇体积分数及料液比4个因素，用紫外－可见分光光度法测定乌头总生物碱，采用HPLC法测定芍药苷，并以其量及浸膏得率作为评价指标，优选了微波法提取制川乌配伍白芍中有效成分乌头总生物碱和芍药苷的工艺条件。

1．3 均匀设计(uniform design) 均匀设计最早由我国数学家方开泰和王元在1978年共同提出，它的基本思路就是尽量使实验点充分均匀分散，使每个实验点具有更好的代表性，但同时舍弃了正交设计中对因素水平“整齐可比”的要求，以减少试验次数;然后根据多元统计方法来弥补这一缺陷，使实验结论同样可靠。它的突出优点是使多因素多水平实验的次数大大减少，一般当因素较多且水平数≥5时，可以考虑均匀设计［3］。

均匀设计首先在我国飞航式导弹的设计中得到有效的应用。近年来，在中药制剂提取工艺的应用逐渐增多［9］。陈新民等［10］运用均匀设计并结合定量指纹图技术优化了丹黄凝胶醇提工艺参数。采用HPLC指纹图谱技术，按U8(82×42)均匀设计考察乙醇体积分数、乙醇用量、提取次数和提取时间4个因素，以大黄酚和小檗碱含量、HPLC指纹图谱特征峰总面积之和以及干浸膏得率为综合评价指标，采用多元非线性拟合，建立效应指标和考察因素之间的数学模型，根据最佳数学模型描绘效应面图和等高线图，确定醇提工艺参数的优化范围及最佳工艺条件。王秀文等［11］采用均匀设计法考察微波功率、提取时间、料液比和提取次数4个因素对党参、茯苓混合水溶性多糖含量的影响，优选微波法提取的适宜条件。陈丽等［12］采用碱溶酸沉与超声波相结合的方法提取柿叶总黄酮，并以柿叶总黄酮含量为评价指标，用均匀设计法优选提取工艺。艾庆波等［13］为确定超临界萃取京万红的最适宜工艺参数，通过U12(12×6×6)均匀设计实验方案，考察压力、温度和夹带剂乙醇浓度的影响，以超临界提取物的出膏率、β，β－二甲基丙烯酰阿卡宁及异欧前胡素含量为指标，采用多因素分析来确定最适宜工艺参数。

1．4 星点设计－效应面法(central composite design－response surface methodology，CCD－RSM) 当因素水平数较多时，国内常用均匀设计和正交设计进行优化，但这两种方法具有实验精度不够，建立的数学模型预测性较差等缺点。近年来国外常用集数学和统计学方法于一体的效应面优化法(response surface methodology，RSM)进行优化［14］，实验设计采用单因素设计及均匀设计的都有［15，16］，但采用星点设计(central composite design，CCD)的较多。

RSM主要考察自变量对效应的作用并对其进行优化。它通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面上选择较佳的效应区，从而回推出自变量取值范围即最佳实验条件的优化法。但必须注意的是，RSM中的自变量必须连续且可被实验者准确控制［17］。对于考察因素是非连续的自变量时，不能使用效应面法进行试验分析。

CCD设计是多因素五水平的实验设计，是在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的。通常实验表是以代码的形式编排的，实验时再转化为实际操作值，一般水平取值为0，±1，±α，其中0为中值，α 为极值，α =(F)1/4，F为析因设计部分实验次数，F=2k(k为因素数)或F=2k×1/2(一般5因素以上采用)CCD［14］。星点设计－效应面法比正交实验法更简化，比均匀设计法更全面，其试验次数较少，试验精度高，并适用于多因素、多水平的实验。该设计法最大的优点是可对未做过的实验进行预测，但同时须有丰富的专业知识和一定的预实验来确定各因素的范围［18］。该方法越来越多被应用于中药提取工艺优选。郜新莲等［19］采用星点实验设计法，以丹皮酚产量为指标，以加水量、浸泡时间和蒸馏液体积为考察因素，采用design expert7．05数据处理系统对牡丹皮中丹皮酚的提取工艺参数进行了预测分析和优化。杨涛等［20］以乙醇浓度、提取时间和溶媒比为自变量，以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的收率和浸膏得率为因变量，通过对自变量的总评归一值进行多元线性回归和二项式拟合，采用星点设计－效应面法优化穿心莲的超声提取工艺条件。陆刚等［21］通过星点设计－效应面法优化酶解参数，并利用多元线性回归和多项式回归建立预测模型，优选出丹参须根有效成分的酶法提取工艺。王秋红等［22］以乙醇体积分数、提取时间、溶媒比为自变量，以升麻总皂苷得率为因变量，通过对自变量各水平的多元线性回归及二项式拟合，用效应面法优选升麻中总皂苷的提取工艺最佳工艺，同时进行了预测分析。

2 数据处理方法

2．1 方差分析(analysis of variance，ANOVA) 方差分析由英国统计学家Fisher首创，为纪念Fisher，以F命名，故方差分析又称F检验(F test)［23］。它是在可比较的数组中，把数据间的总的“变差”按各指定的变差来源进行分解的一种技术。对变差的度量，采用离差平方和，方差分析方法就是从总离差平方和分解出可追溯到指定来源的部分离差平方和。它能根据数据分析找出对该事物有显著影响的因素，各因素之间的交互作用，以及显著影响因素的最佳水平等。方差分析在中药提取精制工艺的研究中应用非常广泛，主要用在正交设计的结果处理中［5－8］。

2．2 回归分析(regression analysis) 回归分析所研究的主要问题就是如何利用变量X，Y的观察值(样本)，对回归函数进行统计推断，包括对它进行估计及检验与它有关的假设等。回归分析可以理解为用一种确定的函数关系去近似代替比较复杂的相关关系，这个函数称为回归函数，在实际问题中称为经验公式。回归分析在药学的研究领域有重要的应用价值，其在中药提取工艺优化等方面的正交设计分析、均匀设计分析方法及星点设计－效应面优化法的结果处理中均有广泛的应用［10－22］。王新春等［24］通过正交实验，用比色法测定有效成分的含量，实验数据经不同的计算和分析比较优选大黄的提取工艺条件。结果数据不同的处理方式得到不同的优化工艺条件，通过验证实验得到可重复的实验结果。结果表明，用多元线性回归计算，可弥补正交极差方差计算的不足，更有利于结果解释和工艺条件的优化。

2．3 人工神经网络(artificial neural network，ANN) 人工神经网络作为一种聚类分析和模式识别方法，是基于模拟大脑神经网络结构和功能而建立的一种信息处理系统和理论化的数学模型，具有能够进行复杂的逻辑操作和非线性表达能力强大等优点。中药有效成分提取分离是非常复杂的过程，传统的经验和方法难于精确反映其多因素多水平的复杂非线性关系，而人工神经网络是以实验数据为基础，经过有限次迭代计算而获得的一个反映实验数据内在规律的数学模型，特别适合于研究复杂非线性系统的特性［25］。刘红梅等［26］以莪术醇含量为响应指标，用BP神经网络和遗传算法优化莪术有效成分的超临界CO2萃取工艺。得出莪术的超临界CO2最佳萃取工艺，测试样本的网络预测值和实际测量值的相对误差＜4%。优化的萃取工艺比常规最小二乘法的优化结果优越。杨铭等［27］采用均匀设计法优化BP神经网络模型，并结合遗传算法获得了丹参最佳提取工艺，实现了BP神经网络结合遗传算法对丹参提取工艺的多目标优化。此外，他们还以同样的方法，优化了秦皮的提取工艺［28］。朱俊访等［29］利用葱白提取工艺均匀设计试验结果，建立神经模型，结合遗传算法对网络模型进行优化，并对实验数据进行拟合，结果表明优化后的神经网络具有较高的预测精度。综上所述，可见每种统计学方法都有其特点和适用范围，不同的实验设计方法，其适用的统计指标的计算方法和统计分析方法也会不同。因此，科研工作者应根据实际情况，进行全面的统计学设计，选择最适合的实验设计和统计学分析方法，才能使研究结果更科学、更真实可靠。在实际的应用中，常常将各种统计方法联合应用，这样可以更加圆满地解决问题。随着统计学、药学、数学及应用软件的快速发展，统计学在中药提取工艺研究方面将做出更为突出的贡献。

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